Capitolul 7

 

  

SENESCENŢA CELULELOR POST-MITOTICE ŞI A STRUCTURILOR EXTRACELULARE

 

  

     Modificări ale membranelor celulare, asociate senescenţei

     Modificări ale fluidităţii membranei. Numeroase cercetări experimentale demonstrează că fluiditatea membranei celulare şi a membranelor organitelor subcelulare scade pe măsura trecerii timpului, atât în cazul senescenţei clonale cât şi în cazul senescenţei celulelor post-mitotice.

     Această scădere contrastează cu creşterea fluidităţii membranelor aparţinând celulelor neoplazice, membrane caracterizate de un nivel scăzut al colesterolului.

     Se ştie că fluiditatea unei membrane celulare depinde în primul rând de compoziţia ei chimică, mai precis, de raportul colesterol/fosfolipide, de raportul acizi graşi nesaturaţi/ acizi graşi saturaţi, de raportul sfingomielină /lecitină, de raportul fosfatidilcolină/fosfatidiletanolamină şi de raportul proteine/lipide (după M.Shinitzky, Biochim. Biophys. Acta, 1984, 738, 251, citat în Rusu et al., 1988)     

     Prin tehnici de rezonanţă electronică de spin şi de rezonanţă magnetică nucleară s-a demonstrat creşterea cu vârsta a ordinii ce caracterizează structura membranelor limfocitare, asociată cu o scădere a fluidităţii lor (rigidizarea membranelor) (B. Rivnay, S. Bergman, M. Shinitzki, A. Globerso - Mech. Ageing Dev., 1980, 12, 119, citat în Rusu et al., 1988).

     Cu ajutorul probei fluorescente, Laurdan, Parasassi et al. (1992) constată scăderea fluidităţii membranelor celulelor k562 cultivate timp de câteva luni.

     Nunoz & Sotomayor (1992) sesizează o scădere a fluidităţii membranelor celulelor de Mycoplasma canadense pe măsura avansării în vârstă a clonei; această scădere este asociată cu o reducere a raportului acizi graşi nesaturaţi/ acizi graşi saturaţi. Fluiditatea scade cu vârsta şi la nivelul membranelor mitocondriale şi microzomale la şobolani (Yu et al., 1992).

     Încercând să verifice experimental ipoteza conform căreia numărul de receptori şi afinitatea acestora pentru proteina G scad cu vârsta în special datorită reducerii fluidităţii membranelor, Frayeman et al.(1993) constată că, spre deosebire de celulele din ficat şi creier unde, într-adevăr, fluiditatea membranelor scade cu vârsta, la celulele epiteliale pulmonare fluiditatea membranară creşte cu vârsta şi nu poate fi, de aceea, cauza alterărilor ce privesc -receptorii membranari.

     Se acceptă că rigidizarea cu vârsta a membranelor este generată de trei factori:

     -creşterea concentraţiei de colesterol în membrană

     -scăderea gradului de nesaturare al lanţurilor acizilor graşi din lipidele membranare

     -creşterea gradului de peroxidare al lipidelor membranare

     Există date publicate din care reiese că peroxidarea lipidică ar putea juca un rol mai important chiar decât creşterea raportului colesterol/fosfolipide sau scăderea raportului acizi graşi nesaturaţi/ acizi graşi saturaţi. într-adevăr, preparatele de membrane peroxidate (microzomi şi lipozomi) pot fi rigide chiar atunci când valorile colesterolului şi cele ale acizilor graşi nesaturaţi sunt normale (Dobretsov et al., 1977; Curtis et al., 1984).

    În cea ce priveşte creşterea cu vârsta a raportului colesterol/fosfolipide, ea se poate realiza atât prin creşterea concentraţiei de colesterol cât şi prin scăderea concentraţiei fosfolipidelor. în cazul mitocondriilor din rinichi şi ficat de şobolan, de exemplu, colesterolul creşte cu 35% în ficat şi cu 70% în rinichi, în timp ce nivelul fosfolipidelor nu se modifică (Grina, 1977). Acelaşi autor, studiind compoziţia membranelor microzomale din ficatul şi din rinichiul şobolanilor, constată că nivelul colesterolului nu se modifică la animalele bătrâne dar concentraţia fosfolipidelor scade cu 18-20%. în eritrocitele care îmbătrânesc, atât colesterolul cât şi fosfolipidele scad, ceea ce face ca raportul colesterol/fosfolipide să nu se modifice prea mult (Winterbourn C. C. & R. D. Batt - BBA 202, 1, 1969, citaţi de Young & Yu, 1994).

     Creşterea cu vârsta a valorii raportului fosfatidil-colină/ fosfatidil-etanol-amină pare să se datoreze în special scăderii în timp a concentraţiei fosfatidil-etanol-amidei, aşa cum arată Grina (1977), care analizează microzomi şi membrane mitocondriale din ficatul şi din rinichii şobolanilor în vârste de 6 luni şi de 24 de luni. 

     În celulele nervoase ale creierului uman, creşterea valorii raportului colesterol/fosfolipide şi a celui de sfingomielină/lecitină determină scăderea fluidităţii membranei pe măsură ce celula avansează în vârstă (M. Shinitzky,Y. Barenholz - Biochim. Biophys. Acta, 1978, 515, 367, citat de Rusu et al., 1988).

     Variaţiile cu vârsta ale concentraţiei diferitelor lipide nu sunt întotdeauna în acelaşi sens. în membrana mitocondriilor şi în microzomii din ficatul de şobolan, acidul linoleic tinde să scadă cu vârsta, spre deosebire de membranele similare din rinichi, unde se înregistrează o creştere cu vârsta a nivelului acidului linoleic (Grina, 1977). într-o grupă de membrane (microzomi şi mitocondrii din ficat), senescenţa induce o creştere a concentraţiei lanţurilor lungi polinesaturate ale acizilor graşi, asociată cu o scădere a concentraţiei acidului linoleic. O altă grupă de membrane (din rinichi sau provenite de la eritrocite) se comportă exact invers din punctul de vedere al variaţiei concentraţiei acizilor graşi nesaturaţi şi a acidului linoleic, pe măsura înaintării în vârstă.

     O analiză a datelor publicate în literatură îl determină pe Yang & Yu (1994) să admită că, în general, raportul acizi graşi nesaturaţi/ acizi graşi saturaţi din diferite preparate membranare (inclusiv microzomi şi mitocondrii) nu se modifică cu vârsta.

     Cel mai adesea, alterarea membranei este explicată prin leziunile produse de atacul radicalilor liberi, îndeosebi peroxidarea lipidelor şi producerea de legături intercatenare (Yang & Yu, 1994).

     Atât lipidele cât şi proteinele pot deveni ţinte ale acestui atac; cea mai mare vulnerabilitate o au acizii graşi polinesaturaţi, mai ales în prezenţa metalelor de tranziţie.

     Pe lângă leziunile structurale produse, peroxidarea lipidică poate fi cauza apariţiei unor specii moleculare agresive, printre care se numără malondialdehida (MDA) şi 4-hidroxinonenol (HNE). MDA se remarcă prin capacitatea ei de a produce legături intercatenare ce afectează lipidele şi proteinele, şi aceasta datorită bifuncţionalităţii părţii sale aldehidice. HNE reacţionează cu compuşi tiolici, producând o rapidă descreştere a puterii reducătoare a grupării SH. Cele două substanţe se fac vinovate şi de accelerarea ritmului de producere a lipofuscinei ca rezultat al acumulării produşilor nedigeraţi alcătuiţi din lipide polimerizate, proteine legate intercatenar şi acizi nucleici oxidaţi.

     Transportul pasiv şi activ prin membranele senescente. Este cunoscut rolul important jucat de structura şi de proprietăţile membranelor celulare în desfăşurarea diferitelor forme de transport transmembranar.

     În ceea ce priveşte transportul pasiv prin canale, s-a constatat că densitatea canalelor de calciu în membrana  celulelor musculare netede din colonul şobolanilor variază semnificativ cu vârsta. Xiong et al. (1993) au măsurat densitatea curentului de calciu prin aceste membrane şi au constatat că ea creşte de peste 5 ori la celulele şobolanului în vârstă de 2 luni faţă de cele ale şobolanului nou născut; după împlinirea vârstei de 2 luni, densitatea canalelor de calciu scade lent cu vârsta.     

     Transportul activ prin membrane, îndeosebi cel efectuat prin pompe ionice alimentate cu energia de hidroliză a acidului adenozin trifosforic (ATP), este, de asemenea, afectat de senescenţa membranelor.

    La majoritatea celulelor din ţesuturile vârstnicilor se constată un declin  al activităţii ATP-azei Na+/K+ sensibilă. Acest declin nu este, însă, o regulă generală. Burke & McKay (1993) observă că densitatea pompelor de Na+ şi K+ din membrana celulelor epiteliului pigmentar din polul posterior al ochiului uman, cultivate in vitro, nu se modifică cu vârsta. Rusu et al. (1988) arată că activitatea ATP-azei Na+/K+ sensibilă în membrana celulelor hepatice poate chiar să crească odată cu înaintarea în vârstă.

     Dependenţa de vârstă a activităţii ATP-azelor Na+/K+şi Mg++/Ca++ dependente  din membranele eritrocitelor va fi expusă într-un capitol special.

    Prelucrarea informaţiei la nivelul membranelor senescente. Membrana celulară joacă un rol important şi în procesele de recepţie şi de transmitere a informaţiei, procese printre care se numără şi declanşarea sintezei de mesageri secunzi, cum este acidul adenozin monofosforic ciclic (cAMP).

     Sugawa & May (1993) constată că în nucleul striat al şobolanului bătrân, nivelul cAMP, este mai scăzut în comparaţie cu situaţia întâlnită la animale tinere. Paradoxal, acivitatea adenilil-ciclazei creşte cu vârsta. Această stare de lucruri nu este, însă, caracteristică tutruror regiunilor din creier; există zone în care activitatea adenilil-ciclazei nu creşte.

     Celula nu se limitează la a recepţiona informaţii din exterior; ea este capabilă să emită informaţii către exterior, necesare stabilirii nivelului de proliferare sau a celui de autodistrugere prin apoptoză .

     Kay (1985) constată că la nivelul membranelor celulelor senescente îşi face apariţia o glicoproteină de circa 62.000 Da care are valoarea unui antigen specific senescenţei celulare. Recunoscut de autoanticorpi, reacţia ce va urma va prilejui atacul macrofagelor şi îndepărtarea celulei bătrâne. Acest antigen senescent apare, probabil, în urma unei modificări conformaţionale la nivelul structurii terţiare a unei proteine din banda 3, cunoscută (în cazul hematiilor) ca principala proteină transportoare de anioni.

     Nu trebuie ignorată nici posibilitatea apariţiei unor complexe proteice la suprafaţa celulei ca urmare a angajării de legături încrucişate între lanţurile macromoleculare proteice. Gagzynska & Bartyosz (1986) demonstrează că în prezenţa cupric-1,10-fenantrolinei, proteinele din membrana eritrocitelor vârstnice manifestă o tendinţă crescută de a angaja legături intercatenare.

     Modificările survenite în numărul, distribuţia şi afinitatea receptorilor ca urmare a înaintării în vârstă sunt ample. Astfel, s-a constatat reducerea numărului de receptori pentru dopamină în nucleul striat al şobolanului. Scăderea densităţii receptorilor este, de regulă, asociată cu scăderea afinităţii lor pentru celelalte componente ale lanţului de prelucrare a mesajelor informaţionale cum ar fi proteinele G (guanin-nucleotid senzitive) sau adenilil-ciclaza (Rusu et al.,1988). Se consemnează şi modificarea distribuţiei  receptorilor, aşa cum este cazul receptorilor -adrenergici care, cu vârsta, nu se mai redistribuie atât de rapid ca în tinereţe sub influenţa ciclului întuneric-lumină (Rusu et al., 1988).

    Se ştie că membrana celulară dispune de un număr de sarcini negative fixe generate de acidul sialic, acidul hialuronic, condroitin-sulfatul şi heparan-sulfatul; acest număr scade pe măsura înaintării în vârstă a celulei, aşa cum arată Mitsui et al. (1985), care măsoară mobilitatea electroforetică a fibroblaştilor proveniţi din pielea umană. Scăderea este mai accentuată în cazul în care  este vorba de persoane care suferă de sindromul Werner care, după cum se ştie, este însoţit de o accelerare a îmbătrânirii.

 

     Anomalii  nucleare şi cromozomale ; leziuni ale acizilor nucleici din celulele senescente

     Diviziuni nucleare amitotice. Andrew (1955) arată că există indicii în favoarea existenţei unor diviziuni amitotice ale nucleului, diviziuni care  ar permite celulei să-şi sporească masa de cromatină necesară. Există, într-adevăr, nuclei multipli în unele celule post-mitotice, dar ei par a-şi avea explicaţia într-un polimorfism nucleic, mai curând, decât într-un proces activ de replicare a ADN. Există o mare varietate de schimbări ce survin în dimensiunea nucleului precum şi în intensitatea colorării lui cu diferite substanţe. în general, în ţesuturile senescente raportul nucleo-citoplasmatic scade cu vârsta (Strehler, 1962).

     Leziuni ale cromatinei. Medvedev (1984), apreciind cromatina ca fiind cea mai complexă parte autoreproducătoare a celulei, atribuie proteinelor cromatinice o foarte accentuată specificitate de ţesut şi de specie. în acest sens, este posibil ca proteinele cromatidiene să fie implicate în procese legate de senescenţă, fiind cunoscut faptul că senescenţa celulară manifestă ea însăşi specificitate de ţesut şi de specie.

       Singh et al.(1986) studiază digestia nucleilor celulelor aparţinând unor exemplare tinere sau vârstnice ale nematodului Caenorhabditis elegans, digestie provocată fie de o nuclează micrococală, fie de DNA-aza I. Cinetica digestiei nu pare să depindă de vârstă; cu toate acestea, creşte cu vârsta procentul nucleotidelor solubile în acizi, apărute în urma digestiei cu DNA-aza I, demonstrând posibile modificări subtile ale cromatinei ce ar surveni pe măsura trecerii timpului.

     Se pare că are loc o intensificare a heterocromatinizării celulelor senescente (Lezhava, 1984), fapt ce ar putea stânjeni eventualele activităţi de reparare enzimatică a genelor afectate şi ar putea duce la aberaţii cromozomale. într-adevăr, Kuznetzova (1987) stabileşte o legătură între polimorfismul cromozomilor referitor la heterocromatina C şi longevitatea umană măsurată în câteva regiuni ale Ucrainei şi Abhaziei.

     O atenţie deosebită a fost acordată, în ultimii ani, tendinţei de pierdere a cromozomilor sexuali, atât la bărbaţi cât şi la femei, cu alte cuvinte, tendinţei celulelor somatice de a fi afectate de aneuploidie. Richard et al. (1994) explică aceasta fie printr-o excesivă pierdere de cromozomi X, fie printr-o supravieţuire mai bună a celulelor cu monosomie X.  Stone & Sanberg (1995) observă că pierderea cromozomului X la sexul feminin şi a cromozomului Y la cel masculin se pot întâlni în special (sau numai la) limfocite periferice şi la celulele măduvii osoase. Nu se poate demonstra vreo consecinţă de ordin patologic a pierderii acestor cromozomi.

     Cu vârsta, creşte şi numărul de celule în care îşi face apariţia un micronucleu (de la 11%  la limfocitele celor sub 10 ani până la 20%, în cazul celor trecuţi de 70 de ani)(Guttenbach et al.,1994). Hando et al. (1994) constată că în 72% din micronuclei a fost identificat cromozomul X. Rezultate similare obţin şi Catalan et al. (1995). Odată cu înaintarea în vârstă creşte frecvenţa aberaţiilor cromozomale la limfocitele provenite de la donatori de peste 65 de ani (King et al., 1994)

    Leziunile acizilor nucleici nucleari, asociate senescenţei. în ciuda remarcabilei lor stabilităţi chimice, acizii nucleici suferă, totuşi, diverse leziuni din partea mediului ambiant. Rezultatele acestor atacuri pot fi mutaţii punctuale (în care o bază azotată este înlocuită cu o altă bază azotată), dimerizări ale unei perechi de baze aflate pe acelaşi lanţ sau pe lanţuri complementare de ADN, rupturi ale unui singur lanţ, rupturi de lanţ dublu, rearanjări de material genetic, transpoziţii ale unor segmente de ADN şi deleţii (sau pierderi) ale unor segmente de ADN.

     Uneori, în ADN-ul cromozomal au loc inserţii ale unor fragmente de ADN străin  provenite de la plasmide, virusuri sau chiar dela ADN-ul mitocondrial din aceeaşi celulă. Alteori, fragmentul inserat este o parte a ADN-ului cromozomal, iar rezultatul este o rearanjare a materialului genetic.

     Numeroase experienţe au arătat tendinţa de acumulare în timp a leziunilor ADN. Astfel, Lawson & Stohs (1985) constată că nivelul leziunilor din ADN creşte în ficatul de şoarece, începând de la vârsta de 6 luni şi  atingând un maximum la vârsta de 18 luni. Principala leziune observată este ruptura unui singur lanţ iar autorii o pun pe seama atacului speciilor reactive de oxigen, deoarece administrarea de antioxidante de tipul hidroxianisolului butilat sau al oltiprazolului duce la reducerea nivelului leziunilor.

     Su et al. (1984) studiază rata acumulării leziunilor ADN la două specii de rozătoare foarte asemănătoare dar dintre care una (Peromyscus leucupus) trăieşte dublu faţă de cealaltă (Mus musculus). Autorii citaţi constată că leziunile ADN nu se acumulează în creier, dar există tendinţa acumulării lor în ficat şi în alte organe. Rata acumulării variază invers proporţional cu durata maximă de viaţă a organismului de la care s-au recoltat probele de ADN supuse investigaţiei. Autorii cred că există o diferenţă între pragurile de tolerare a leziunilor ADN la diferite specii, de aceste praguri depinzând durata maximă de viaţă a vieţuitoarelor respective.

     Confirmând tendinţa de acumulare a leziunilor ADN în celulele post-mitotice ale mamiferelor, Holmes et al. (1992) apreciază că scăderea capacităţii ADN de a servi drept matriţă pentru trancriere (sinteză de m-ARN) este cauza fundamentală a senescenţei. Cauza primară ar fi, cred autorii, atacul oxidativ al radicalilor liberi celulari.

     Studiile efectuate de Klass et al. (1983) pe Caenorhabditis elegans cu ajutorul ADN-polimerazei extrasă de la Escherichia coli au pus în evidenţă rupturi de lanţ  şi au demonstrat că numărul acestora creşte cu vârsta. ADN-ul prelevat de la exemplare bătrâne a fost testat într-un sistem de transcriere in vitro, folosindu-se celule HeLa şi constatându-se că ADN-ul nematodelor bătrâne are o capacitate mai redusă de transcriere.

     Paradoxal, este posibil ca o leziune la nivelul ADN să prelungească durata de viaţă. Astfel, o mutaţie survenită la nivelul genei age-1 la Caenorhabditis elegans creşte durata medie a vieţii acestuia cu 65% iar durata maximă de viaţă cu 70%. Rata de creştere a mortalităţii se reduce cu 50% (Johnson, 1990).

     Scăderea cu vârsta a capacităţii de reparare a leziunilor acizilor nucleici. ADN-ul cromozomal lezat dispune de numeroase mecanisme de reparare, care, în principiu, constau în excizia fragmentului purtător de leziune şi reconstituirea lui în forma corectă prin sinteză cu ajutorul matriţei oferite de porţiunea intactă de pe lanţul ADN complementar.

     Această reconstituire nu mai este posibilă atunci când ambele lanţuri complementare sunt afectate în aceeaşi regiune topografică, deoarece în acest caz excizia se soldează cu o pierdere definitivă de informaţie genetică.

     Acumularea unor leziuni ale ADN poate avea loc fie prin mărirea numărului de agresiuni izbutite împotriva materialului genetic, fie prin scăderea capacităţii de autoapărare a ADN, fie, desigur, prin ambele căi. în mod special, capacitatea de reparare prin excizie a fost mult studiată la diferite specii.

     Radiaţiile ultraviolete au fost folosite în multe  experienţe ca mijloc prin care se produc leziuni ale ADN, în vederea evaluării capacităţii lui de autoreparare.

     Hall et al. (1984) produc leziuni ale ADN prin iradiere cu radiaţii ultraviolete şi stabilesc o corelaţie pozitivă între durata maximă de viaţă a indivizilor aparţinând unor specii şi capacitatea de reparare a leziunilor.

     Niedermuller et al. (1985) studiază mecanismul de reparare al ADN la nivelul a nouă tipuri de organe aparţinând unor şobolani de 9, 18 şi 28 luni. Autorii urmăresc repararea exciziilor, repararea rupturilor unui singur lanţ şi cea a rupturilor lanţului dublu şi constată că doar  eficienţa celui de al doilea tip de reparare scade uşor cu vârsta. Autorii observă, de asemenea, că susceptibilitatea ADN-ului la atacul cu gamma-endonuclează creşte cu vârsta. 

     Targovnik et al.(1984), studiind nematodul Turbatrix aceti, arată că exemplarele tinere dispun de o capacitate superioară de reparare a leziunilor ADN.

     Maslanski & Williams (1985) arată că celulele hepatice provenind dela cinci specii de mamifere îşi repară leziunile ADN (produse prin iradiere cu radiaţii ultraviolete în doze mici) într-un ritm mai mare la cobai şi la iepure decât la şoarece şi la şobolan. S-ar părea că potenţialul de reparare este direct proporţional cu durata maximă de viaţă caracteristică speciei. în realitate, s-a constatat că pentru doze mari de ultraviolete, capacitatea de reparare este aceeaşi la toate speciile, deci toate au acelaşi potenţial maxim de reparare a leziunilor ADN, indiferent de durata de viaţă.

     Ishikawa (1985) investighează celule epiteliale tegumentare prelevate de la şoareci tineri şi bătrâni, folosind tehnica autoradiografiei. în cazul dozelor mici de ultraviolete, răspunsurile au fost foarte asemănătoare la toate vârstele. La iradierea cu doze mari, răspunsurile diferă, în sensul că la animalele bătrâne, dozele mari afectează într-o mai mare măsură mecanismele de reparare ale ADN.

     Hartman et al. (1988) au studiat sensibilitatea la radiaţii ultraviolete, radiaţii gamma precum şi la metil-metan-sulfat a unor linii de Caenorhabditis elegans caracterizate de durate diferite de viaţă. Nu s-a constatat vreo relaţie între durata de viaţă a nematodelor şi efectul letal al acestor agenţi. în orice caz, animalele cu viaţă lungă nu s-au dovedit mai capabile să-şi  reparare leziunile ADN. Acest fapt determină pe mulţi autori să considere că procesele de reparare ale ADN joacă, în cel mai bun caz, un rol minor în senescenţa acestui nematod.

    Şi alţi autori (Rao & Loeb,1992) menţionează că încercările de a demonstra declinul proceselor de reparare a ADN odată cu înaintarea în vârstă au dus la rezultate contradictorii.

     Creşterea frecvenţei transpoziţiilor în ADN-ul senescent. Un fenomen care are loc în genom şi care ar putea avea legătură cu senescenţa este procesul de transpoziţie, în care un segment al ADN rămâne în poziţia lui normală, în timp ce o copie a lui, numită transpozon, se plasează în alt loc al genomului. Transpozonii pot inactiva gene esenţiale pentru celula care îi găzduieşte. împreună cu procesele de revers-transcriere, transpoziţia poate fi o cauză a senescenţei celulare. Murray (1990) constată creşterea numărului de transpozoni odată cu înaintarea în vârstă. Unul dintre cei mai cunoscuţi transpozoni descoperiţi la Caenorhabditis elegans, numit TC 1, poate fi inserat în diferite locuri ale genomului. Acest fapt poate deveni, aşa cum arată Schukkink & Plasterk (1990), principala cauză a unor mutaţiilor spontane.

     Micşorarea raportului ARN/ ADN în celulele senescente. In ceea ce priveşte posibila alterare cu vârsta a ARN  există mai puţine date publicate în literatura de specialitate. Singh et al. (1986) arată că ARN-ul organismelor vârstnice de C.elegans este mai expus atacurilor enzimatice, probabil pentru că este mai puţin protejat de proteine. Fapt este că raportul ARN/ ADN scade cu vârsta; scade, deasemenea, şi cantitatea absolută de ARN, simultan cu scăderea nivelul sintezei proteice.

     Modificarea gradului de metilare al acizilor nucleici.  Nivelul metilării ADN se bucură de o atenţie specială. El pare a fi implicat  în fenomenele de senescenţă celulară, în măsura în care metilarea ADN are importanţă în exprimarea genelor, adică în transcrierea lor în vederea traducerii. Singura bază azotată care poate fi metilată este citozina, care acceptă o grupare metil în poziţia 5.  Citozinele metilate (aproximativ 3% din totalul citozinelor) se întâlnesc mai ales în segmentele de ADN având secvenţa bazelor de tipul CGCG sau CCGG. Recent, Clark et al. (1994) comunică o metodă care permite detectarea oricărei citozine metilate provenind din ADN-ul recoltat de la mai  puţin de 200 de celule.

     Din ceea ce se ştie astăzi, hipermetilarea împiedică exprimarea genică, iar hipometilarea o favorizează;  acolo unde o proteină nu se sintetizează, gena care o codifică este hipermetilată iar acolo unde sinteza acelei proteine are loc, gena este hipometilată sau nemetilată.

     În momentul replicării ADN, citozina apare nemetilată în lanţul nou format, astfel încât celula fiică va avea  doar un lanţ metilat, celălalt lanţ fiind încă nemetilat. Citozinele din cel de al doilea lanţ vor fi, însă, curând metilate de către o enzimă specială numită enzimă de menţinere a metilării; vor fi metilate acele citozine care corespund secvenţial citozinelor metilate din primul lanţ (cel moştenit de la celula mamă). în linii generale, celulele somatice se caracterizează printr-o scădere cu vârsta a gradului de metilare a ADN-ului (Cooney, 1993).

     Mazin (1993-a) analizează ritmul de pierdere a 5-metilcitozinei din ADN-ul celulelor cultivate in vitro. El constată că rata pierderii de 5-mC este invers proporţională atât cu limita de dublare celulară Hayflick caracteristică respectivei culturi, cât şi cu durata maximă de viaţă caracteristică speciei de la care s-au prelevat celulele cultivate. în liniile celulare nemuritoare, conţinutul de 5-mC este constant sau creşte cu vârsta. Autorul ajunge la concluzia că metilarea ADN-ului este un mecanism programat genetic, care duce la acumularea cu vârsta a mutaţiilor.

     Într-o altă lucrare, Mazin (1993-b) studiază conţinutul 5-mC în ficatul şobolanilor de diferite vârste şi ajunge la concluzia surprinzătoare (despre care afirmă că este prima referire de acest fel în literatură) că de-a lungul vieţii, genomul pierde, practic, toate rezidurile de 5-mC. Acelaşi Mazin (1994) găseşte o relaţie de proporţionalitate între rata hipometilării ADN şi rata îmbătrânirii, atât in vivo cât şi in vitro. El consideră că 5-mC poate fi apreciată ca un bun marker al senescenţei, cu atât mai mult cu cât la celulele aparţinând liniilor nesenescente, 5-mC are tendinţă de creştere cu timpul.

     Wilson et al. (1987) constată o pierdere cu vârsta a 5-metil citozinei; rata pierderii este invers proporţională cu durata de viaţă caracteristică speciei respective. într-adevăr, Peromyscus leucopus, care, aşa cum s-a mai spus, trăieşte dublu faţă de Mus musculus, pierde lunar 23.000 reziduri de 5-mC  (adică 0,006% din numărul total de astfel de reziduri la data naşterii) faţă de 47.000 reziduri (0,012%) pierdute lunar de Mus musculus.

     Singhel et al. (1987) constată o scădere a 5-mC  din ficatul şoarecilor, începând din luna a şasea de viaţă şi până la vârsta de 24 de luni, după care nivelul citozinei metilate nu mai scade sau chiar creşte puţin. Din considerente ce nu vor fi expuse aici, autorii cred că hipometilarea DNA este un proces activ.

     Ono et al. (1989) studiază gena c-myc din splina şi din ficatul aparţinând unor şoareci în vârstă de 2, 14 şi 26 de luni. Ei constată că, pe tot acest interval de timp, nu au loc nici amplificări şi nici rearanjări de gene. în schimb, se modifică profilul metilării ADN. în mod normal, gena c-myc are, cu 2000 de baze în amonte de capătul 5' al primului exon şi până către capătul 3' al primului intron, un domeniu nemetilat, flancat de regiuni parţial metilate. Aceste regiuni îşi modifică nivelul metilării odată cu trecerea timpului. Astfel, în ficat, capătul dinspre 3' al domeniului nemetilat se hipermetilează. La splină se constată o hipometilare la ambele capete ale domeniului nemetilat.

     Drinkwater et al. (1989) studiază gradul de metilare al secvenţei de nucleotide Cm-CGG  în ADN-ul din limfocitele unor tineri în vârstă  de 25 de ani şi din limfocitele unor bătrâni de 75 de ani. Celulele persoanelor bătrâne au mai puţin 5-mC atât în ADN-ul activ transcripţional din care s-a extras secvenţa analizată cât şi în genomul integral. Autorii citaţi susţin implicarea hipometilării în senescenţă, subliniind legătura dintre reglarea genică şi distribuţia metilării în ADN.

     Tawa et al. (1992) ajung la concluzii diametral opuse, constatând că ADN-ul din ficatul diferitelor specii de mamifere nu îşi micşorează conţinutul de 5-mC odată cu înaintarea în vârstă iar scăderea 5-mC în splină se dovedeşte a fi foarte mică. în consecinţă, autorii lucrării apreciază că hipometilarea ADN nu este o caracteristică a senescenţei la mamifere.

     Rezultatele numeroaselor cercetări întreprinse în această direcţie sunt destul de greu de interpretat, deoarece apar numeroase contradicţii, atât în ceea ce priveşte modul în care este descris unul şi acelaşi sistem biologic de către mai mulţi cercetători cât, mai ales, al modului în care par să se comporte celule aparţinând unor tipuri diferite de ţesuturi ale aceluiaşi organism.

     Astfel, deşi Simpson et al. (1986) afirmă că nematodul Caenorhabditis elegans nu conţine 5-mC în nici o fază a evoluţiei sale, Klass et al. (1983) vorbesc despre o creştere exponenţială a nivelului de 5-mC  pe măsură ce nematodul avansează în vârstă.

     Ono et al.(1993) semnalează scăderea cu vârsta a metilării genomului în ficatul de şoarece dar nu în ficatul de om şi nici în creierul de şoarece.

     Flodin (1984) ajunge la concluzia că mecanismul de bază al senescenţei este conversia progresivă a 5-mC din segmentele ADN, acest fapt putând duce la scăderea numărului de promotori ai transcrierii.

 

     Senescenţa mitocondriilor, lizozomilor şi peroxizomilor

     Creşterea cu vârsta a dimensiunilor mitocondriilor. Mitocondriile provenite de la animale vârstnice se deosebesc de cele ale animalelor tinere din numeroase puncte de vedere. Bertoni-Freddari et al. (1993) constată, de exemplu, că procentul mitocondriilor care au o lungime mai mare de 5m este 20 la şobolanii bătrâni, 5,3 la adulţi şi 8,6 la tineri. Aceste date se referă la mitocondriile din terminaţiile sinaptice din cerebel.

     Scăderea cu vârsta a activităţii enzimelor mitocondriale. Bowling et al. (1993) au întreprins o cercetare ce viza enzimele care catalizează fosforilarea oxidativă în mitocondrii, studiind complexele I, II-III, IV şi V şi constatând că se poate vorbi de o scădere cu vârsta doar a activităţii complexelor I şi IV.

     În miocardul de şobolan, activitatea NADH-citocrom-c-reductazei, a citocrom-oxidazei şi a ubiquinol citocrom-c-reductazei scade treptat, începând cu a 18-a săptămână de viaţă, în timp ce activitatea succinat citocrom-c-reductazei creşte monoton de-a lungul întregii vieţi (Castelluccio et al., 1994).

     Muller-Hocker et al. (1992) studiază citocrom-c-oxidaza (complexul IV al lanţului respirator) în muşchii extraoculari ai omului şi constată defecte ale succinat-dehidrogenazei ce apar întotdeauna începând cu al doilea deceniu de vârstă. Scăderea activităţii citocrom-c-oxidazei s-ar datora unei absenţe aproape complete a subunităţilor de provenienţă nucleară şi mitocondrială ale acestei enzime, ceea ce arată participarea factorilor nucleari în declinul lanţului respirator în cursul senescenţei.

     Hsieh et al. (1994), studiind mitocondriile din fibrele musculare, constată că înaintarea în vârstă este asociată cu scăderea activităţii citocrom-c-oxidazei, mai puţin a NAD citocrom-c-reductazei şi deloc a succinat-c-reductazei.

     La Drosophila melanogaster, Nassie & Kogut (1987) constată că activitatea specifică a cel puţin patru tipuri de enzime nu se modifică pe măsură ce insecta înaintează în vârstă; ei nu pot, însă, formula concluzii generale, recunoscând că enzimele studiate reprezintă doar un mic procent din totalitatea enzimelor ce acţionează în mitocondrie.

     Lezarea cu vârsta a membranei interne mitocondriale. Membrana internă a mitocondriei pare a fi partea cea mai afectată a acestui organit celular, ca urmare a îmbătrânirii.

     Conform celor afirmate de Shigenaga et al. (1994), fluiditatea membranei interne scade cu vârsta, odată cu micşorarea concentraţiei  de cardiolipin (despre care se ştie că este implicat în funcţia multor proteine ce intră în alcătuirea acestei membrane). Scade, de asemenea, rata transferului de protoni prin membrana internă. Dipotrivă, Castelluccio et al. (1994) consideră că fluiditatea membranelor mitocondriale din inima de şobolan nu este semnificativ modificată de vârstă.

     Turpeenoja et al. (1988) separă membrana internă de cea externă şi de matrixul mitocondriilor din neuronii cerebelului unor şobolani de diferite vârste şi analizează proteinele extrase din aceste structuri prin gel-electroforeză. Nu s-au constatat modificări ale proteinelor din matrix sau din membrana externă mitocondrială; în schimb, proteinele membranei interne au arătat leziuni care se agravează cu trecerea timpului.

     Leziunile ADN-ului  mitocondrial, asociate senescenţei. în ultimii ani au fost întreprinse numeroase cercetări privind implicarea în senescenţa celulară a ADN-ului mitocondrial (mt-ADN), despre care Takasawa et al. (1993) afirmă că scade cantitativ cu 58% la şobolanii în vârstă de 100 de săptămâni faţă de cei ce au  numai 7 săptămâni de viaţă.

     Se ştie că mt-ADN are formă circulară, fiind asemănător ADN-ului bacterian. El se sintetizează la nivelul membranei interne mitocondriale, în imediata vecinătate a locului unde apar speciile reactive de oxigen care sunt, după cum se ştie, radicali liberi foarte agresivi. Faptul că mt-ADN nu dispune de mecanismele de reparare prin excizie şi recombinare ale ADN-ului nucleic îl face foarte vulnerabil la atacul radicalilor liberi.

     ADN-ul mitocondrial conţine 13 gene pentru tot atâtea proteine hidrofobe ce alcătuiesc compartimentele lanţului respirator şi de sinteză a ATP, precum şi gene necesare sintezei mt-ARN ribozomal şi de transfer.

     Piko et al. (1984) constată creşterea cu vârsta a formelor catenate ale mt-ADN, adică a acelor molecule de ADN formate din două sau mai multe unităţi circulare interconectate. Se remarcă în mod deosebit frecvenţa crescută a dimerilor circulari de mt-ADN, deşi nu în aceeaşi măsură la specii diferite şi la ţesuturi diferite (numărul dimerilor creşte cu 1,9% la creier de şoarece, cu 1,5% la rinichi de şobolan, cu 0,4-0,7% în inima de şoarece şi în cea de şobolan). Autorii cred, de altfel, că această creştere face parte din deteriorările fiziologice ale ţesutului şi că nu este un semn specific de senescenţă mitocondrială.

     Richter (1992) constată că nivelul de 8-hidroxi-deoxiguanozină în mt-ADN creşte odată cu înaintarea în vârstă, ceea ce poate explica atât mutaţiile punctuale cât şi deleţiile care, în opinia autorului, stau la baza senescenţei celulare ca, de altfel, şi a multor boli. încă şi mai clar se exprimă Miguel (1992) când afirmă că senescenţa metazoarelor se explică prin mutaţii, inactivări şi deleţii ce au loc în genomul mitocondrial al celulelor post-mitotice.

     Într-adevăr, Linnane et al. (1992) constată mutaţii aleatorii precum şi deleţii care afectează mt-ADN cu o frecvenţă care creşte cu vârsta. Nu de aceeaşi părere sunt Hayashi et al. (1994) care afirmă că acumularea cu vârsta a mutaţiilor, deşi există, se petrece numai în nucleu şi chiar dacă acest fapt este urmat de disfuncţii mitocondriale, nu este vorba de mutaţii ale ADN-ului mitocondrial.

     Zhang et al. (1993) demonstrează, însă, existenţa unei mutaţii prin care adenina din poziţia 3243 a mt-ADN-ului uman este înlocuită cu guanina. Numărul acestor mutaţii creşte odată cu înaintarea în vârstă.

     În schimb, Calleja et al. (1993), studiind integritatea genomului mitocondrial al musculiţei Drosophila melanogaster, constată excepţionala lui stabilitate; efectele senescenţei par a se concentra în aval de mt-ADN, adică în procesul transcrierii şi traducerii informaţiei ADN-ului cromozomal.

     Bittles (1992) se referă la deleţia (pierderea) unui fragment de circa 5 kb (mai precis, 4977 perechi de baze), deleţie ce are loc atât la om cât şi la animalele investigate, atribuind acestei deleţii consecinţe importante legate de sinteza de ATP, NADPH precum şi de apărarea contra radicalilor liberi.

     De fapt, la animale nu este vorba de o deleţie absolut identică cu cea de 4977 pb a omului. Astfel, la bovine principala deleţie este de 5,3 kb, nivelul ei crescănd de 100-1000 ori de la naştere până la bătrâneţe (Marin Garcia et al., 1994) iar la şobolani, deleţia predominantă este cea de 4834 pb care, în intervalul 6-24 de luni de viaţă creşte de circa 100 de ori (Edris et al., 1994). Există similitudine dar nu identitate şi în ceea ce priveşte celelalte deleţii. Brossas et al. (1994) identifică la şoarece deleţiile de 3726, 3867 şi 4236 pb.

     În cortexul frontal al oamenilor având vârste cuprinse între 71 şi 95 de ani, mt-ADN caracterizat de  deleţia 4977 pb reprezintă 0,13% din mt-ADN-ul total (Blanchard et al., 1993).

     În celulele din pielea umană, deleţia 4977 apare numai după vârsta de 60 de ani la 20% dintre cei având vârsta cuprinsă între 61 şi 70 de ani, la 46% pentru vârstele 71-80 de ani şi la 83,4% după 81 de ani. Incidenţa deleţiei este mai crescută în pielea expusă luminii (Yang et al., 1994).

     Corral-Debrinski et al. (1992-a) studiază deleţiile mt-ADN din miocard constatând prezenţa unor fragmente de 4977 perechi de baze al căror număr creşte în timp cu maximum 0,007% precum şi alte fragmente de 7436 şi 10.422 perechi de baze provenind tot din deleţii. Frecvenţa acestor deleţii creşte după vârsta de 40 de ani.

     Într-un alt articol, Corral-Debrinski et al. (1992-b) constată o creştere semnificativă a deleţiilor mt-ADN 4977 la oamenii bătrâni. Fracţiunea de mt-ADN care prezintă acest tip de deleţie creşte în cortex de la 0,00023 la 0,012 la oameni de 67-77 de ani şi la mai mult de 0,034 la subiecţi de peste 80 de ani. Variaţii similare au fost observate şi în ceea ce priveşte deleţia de 7436 perechi de baze.

     Hsieh et al. (1994) găsesc că deleţia 4977 apare după 36 de ani iar 70% dintre cei trecuţi de 60 de ani o au. Deleţia 6063 poate fi găsită la 47,2% din cei trecuţi de 60 de ani iar deleţia 7436 se remarcă prin variaţii foarte mari de la un individ la altul.

     Soong et al. (1992) sugerează, însă, că deleţia 4977 poate fi doar 'vârful icebergului' constituit de întreaga gamă de mutaţii şi leziuni ale ADN-ului mitocondrial.

     Arnheim şi Cortopassi (1992) constată că deleţiile de 4977 pb se acumulează cu vârsta în celulele post-mitotice nervoase şi musculare, frecvenţa lor crescând în creier de circa 1000 de ori. Acumularea acestor fragmente de deleţie este mai evidentă în ţesuturile caracterizate de un consum sporit de oxigen. Există două grupe de deleţii. Prima se caracterizează prin faptul că extremităţile 5' şi 3' ale fragmentelor ce urmează să fie pierdute sunt flancate de secvenţe repetitive alcătuie din 4 sau mai multe nucleotide; a doua grupă nu are această caracteristică.

     Fragmentele de deleţie ale mt-ADN se pot insera în genomul nucleic putând, astfel, deveni posibile cauze ale senescenţei şi cancerului. Aşa cum arată Shay şi Werbin (1992), fragmente ale mt-ADN se inseră, într-adevăr, în genomul nucleic. Folosind celule HeLa, autorii arată că secvenţe ale mt-ADN care codifică subunitatea III a citocrom-oxidazei C sunt plasate în contact cu capetele 5' ale exonilor 2 şi 3 ai oncogenei c-myc. Această genă himerică a fost chiar transcrisă. Se consideră că inserţia unor asemenea fragmente în genom se face fie direct, fie plecând dela fragmente de mt-ARN din vacuolele autofagice care dau naştere inserţiilor în ADN-ul nucleic prin revers-transcriere.

     Deşi este neîndoielnic faptul că numărul deleţiilor în mt-ADN creşte cu vârsta, Gadaleta (1992) apreciază că procentul în care au ele loc este mult prea mic pentru a susţine ipoteza rolului primar sau principal al leziunilor mt-ADN în senescenţa celulară, mai cu seamă că ei constată că în celulele vârstnicilor există o cantitate mai mare de mt-ADN decât în cele ale adulţilor.

 

     Implicarea lizozomilor şi peroxizomilor în procesele, asociate senescenţei. Şi lizozomii par a fi puternic implicaţi în fenomenele de senescenţă celulară; termenul de lizozom defineşte numeroase structuri delimitate de membrane, ale căror element comun este prezenţa hidrolazelor.

     Rolul lizozomilor este dublu. Pe de o parte, ei contribuie la nutriţia celulei prin digestia corpurilor fagocitate (şi, uneori, chiar prin digestia unor porţiuni din propria celula - autofagie) iar, pe de altă parte, participă la apărarea celulei prin distrugerea unor particule străine sau prin limitarea extinderii unor procese celulare degenerative, mergând, uneori, până la autodistrugere. Lizozomii sunt principalii răspunzători pentru producerea pigmenţilor de vârstă, mai ales a lipofuscinei.

     Din rândul lizozomilor se desprind, ca entităţi distincte, peroxizomii, care sunt organite de mici dimensiuni având funcţia de a cataboliza bazele purinice provenite din degradarea acizilor nucleici, de a participa, alături de mitocondrii, la beta-oxidarea acizilor graşi (până la radicalul acetil ce se va combina cu coenzima A) precum şi la reglarea catabolismului glucozei prin oxidarea NADH.

     Beier et al. (1993) studiază alterarea cu vârsta a peroxizomilor hepatici şi a enzimelor pe care aceştia le conţin. Catalaza şi acetil-CoA-oxidaza au o activitate scăzută în peroxizomii şobolanilor în vârstă de 39 de luni în comparaţie cu cei ai şobolanilor de numai 2 luni. în schimb, creşte cu vârsta activitatea tiolazei şi a urat-oxidazei. Dacă hepatocitele şobolanilor tineri conţin aproximativ acelaşi număr de peroxizomi indiferent de localizare,  la şobolanii bătrâni numărul peroxizomilor este mai mare în celulele pericentrale faţă de celulele periportale. Autorii cred că, odată cu vârsta, survin modificări importante ale peroxizomilor, cu consecinţe asupra metabolismului lipidic. în plus, scăderea catalazei şi creşterea urat-oxidazei pot contribui la aşa numitul stress oxidativ care pare a fi implicat în senescenţă.

 

     Apariţia şi acumularea unor reziduri metabolice în celulele post-mitotice

    Acumularea lipofuscinei în celulele senescente. Majoritatea autorilor constată tendinţa de acumulare intracelulară a lipofuscinei pe măsura înaintării în vârstă a celulelor post-mitotice (detalii cu privire la natura şi proprietăţile lipofuscinei vor fi prezentate în capitolul 9).

     Strehler (1962) calculează rata acumulării lipofuscinei în miocardul uman şi constată o relaţie de liniaritate, 0,3% din volumul celular fiind ocupat, în decursul unui deceniu, de lipofuscină. în miocardul unei persoane de 90 de ani, lipofuscina ocupă 6-7% din volulmul celular (fig.13).

 

 

     Fig. 13 - Reprezentare grafică a acumulării lipofuscinei în fibrele miocardice (pe ordonată este înscris

procentul din volulul celular ocupat de pigment)   

 

     Kikugava et al. (1994) constată că, la şobolan, organul care se remarcă prin cel mai ridicat nivel al acumulării de lipofuscină pe măsura înaintării în vârstă este rinichiul. Acumulări mari de lipofuscină au fost observate şi în celulele epiteliului retinian al şobolanilor bătrâni (Rapp et al., 1994).

      După Gordin (1974), cele mai bogate depozite de lipofuscină se întâlnesc în testiculele rozătoarelor (caracterizate de un nivel foarte mare de acizi graşi polinesaturaţi), în creier, inimă şi testicul la cobai şi câini precum şi în celulele tractului gastro-intestinal al muştelor (unde lipofuscina poate ocupa, către sfârşitul vieţii, peste 50% din volumul celular).

     Sohal et al. (1984) studiază lipofuscina din celulele muştelor în vârstă de 3 şi 13 zile, constatând că, în acest interval, volumul ocupat de pigment creşte de 2-3 ori (în funcţie de tipul celulei investigate) şi nu depinde de gradul de oxidare al acizilor graşi polinesaturaţi.

     La melcul Planorbis din al cărui regim alimentar lipseşte vitamina E, concentraţia lipofuscinei în nevroglii creşte, cu vârsta, de peste 100 de ori. In prezenţa vitaminei E, rata acumulării se reduce la jumătate (Winstanley & Pentreath, 1985).

     Dowson (1989) realizează o cercetare complexă a lipofuscinei neuronale, constatând că se poate vorbi de o corelaţie directă între nivelul lipofuscinei şi vârsta subiectului investigat precum şi de variaţia cantităţii de pigment galben în diferite boli cum ar fi demenţa Alzheimer şi ceroidoza neuronală. Tot el constată variaţii ale conţinutului de lipofuscină în cazul administrării cronice a unor  droguri ca dihidroergotoxină, etanol, centrofenoxină, clorpromazină. Drogurile care scad concentraţia de lipofuscină (de exemplu, centrofenoxina) par a avea efect benefic asupra ţesuturilor, probabil ca urmare a eliminării cauzelor care duc la acumulare de pigment, cauze legate de atacul radicalilor liberi.

     Cei mai mulţi autori consideră că lipofuscina nu este toxică dar poate aduce prejudicii celulei prin micşorarea volumului efectiv disponibil şi prin stânjenirea difuziei unor molecule şi ioni sau a circulaţiei unor molecule semnal (Gordin, 1974).

     În legătură cu acumularea în timp a pigmentului galben, este interesant faptul că unele celule nu sunt deloc afectate, dar altele încep foarte devreme să conţină acest pigment. De exemplu, la şoareci, neuronii mari din nucleul vestibular lateral acumulează cu vârsta mult mai multă lipofuscină decât neuronii mici. Trebuie remarcat, de altfel, că în timp ce numărul neuronilor mici rămâne constant cu vârsta, numărul neuronilor mari scade de la 488 la vârsta de 25 luni, la 298 la vârsta de 31 luni (Sturrock, 1989). Administrarea de acetil-L-carnitină (ALCAR) reduce în mod semnificativ acumularea de lipofuscină în neuronii piramidali cerebrali (Amenta et al.,1989).

     Alcoolismul cronic creşte rata acumulării cu vârsta a lipofuscinei în creier. Suprimarea alcoolului, după cum arată Paula-Barbosa et al. (1991), creşte încă şi mai mult rata acumulării, fenomen ce poate fi contracarat prin administrare de piracetamol, ale cărui proprietăţi antioxidante şi de protecţie a membranelor intra-neuronale sunt cunoscute.

     Davies et al. (1983) constată că neuronii nucleilor supraoptici prelevaţi de la şoareci tineri (6 luni) şi bătrâni (28 luni) produc aceeaşi cantitate de granule neurosecretorii ce conţin hormoni, deşi neuronii şoarecilor bătrâni conţin mai multă lipofuscină decât cei ai şoarecilor tineri, pledând pentru lipsa de toxicitate a pigmentului galben. La concluzii similare ajung şi Collins & Thaw (1983) care arată că acumularea lipofuscinei, chiar masivă, nu afectează capacitatea celulelor nevrogliale umane de a supravieţui subcultivării artificiale şi de a reintra în ciclul celular normal.

     Acumularea de lipofuscină este mai rapidă în culturile de celule in vitro, aşa cum arată rezultatele experienţelor lui Thaw et al. (1984); diferite substanţe pot accelera sau reduce ritmul de acumulare a pigmentului galben (prooxidanţi ca vitamina C, antioxidanţi ca vitamina E, dimetilsulfoxidul, glutationul redus etc.). Metil-fenil-tetrahidropiridina (MPTP) induce acumularea rapidă a lipofuscinei în neuronii dopaminergici ai retinei; Hadjiconstantinou et al. (1987) cred că acest efect este legat de radicalii liberi ce apar în procesul metabolizării MPTP.

     În ceea ce priveşte vârsta la care lipofuscina îşi face apariţia, Nakano et al. (1993) constată că la maimuţele Macaca fascicularis, pigmentul galben apare în miocard la vârsta maturizării sexuale iar rata acumulării ulterioare nu depinde de durata de viaţă caracteristică diferitelor specii de primate ale căror reprezentaţi au fost analizaţi.

     Odată cu vârsta, apar şi alte depozite de produşi greu metabolizabili. Aşa sunt granulele ceroid-lipofuscinice, bogate în enzime lizozomale şi fluorescente. Ele au, spre deosebire de granulele de lipofuscină, un profil lamelar caracteristic (Wisniewki & Wen, 1988).

 

    Depuneri de amiloid în ţesuturile senescente. Herriot & Walker (1989) studiază componenta P a amiloidului în testicolul uman, de-a lungul înaintării în vârstă. Amiloidul P este invariabil detectat în asociaţie cu fibrele elastice din jurul tubilor seminiferi şi în vasele sangvine, mai ales după vârsta de 30 de ani şi niciodată sub 18 ani. Yokota et al. (1989) măsoară activitatea factorului de intensificare amiloidă (AEF) în splina de diferite vârste şi constată că acesta creşte cu timpul.

     Morys et al. (1994) constată că, la câini, depunerile de amiloid în creier încep la vârsta de 17 ani şi progresează rapid în intervalul 17 - 19 ani.

     Depunerile de amiloid în creier se fac sub formă de plăci de amiloid (numite şi plăci neuritice sau plăci senile). Principala componentă a acestor plăci este un polipeptid solubil alcătuit din 42 de aminoacizi (numit 42 aa- beta-amiloid sau proteina A4) care provine dintr-un precursor ce are o moleculă mult mai mare şi care este sintetizat în toate tipurile de celule; cu toate acestea, principalul (dacă nu singurul) organ în care apar depuneri de beta-amiloid este creierul.

     Meier-Ruge et al. (1994) crede că declanşarea acumulării de beta-amiloid în creier  este reducerea sub 50% a turnoverului energiei oxidative, metabolismul normal al precursorului de amiloid fiind afectat de lipsa de ATP. La rândul lor, Nakamura et al. (1994) susţin că expresia, metabolismul şi transportul precursorului beta-amiloid sunt afectate de procesele senescente.

     În cazul sindromului Down şi al bolii Alzheimer se constată depuneri mari de amiloid în creier (Friedlich & Butcher, 1994). De altfel, plăcile senile şi aşa numitele împâsliri neurofibrilare intraneuronale pot fi considerate semne patognomonice în boala Alzheimer (Beeson et al., 1994).

     Printre pigmenţii care se acumulează cu vârsta în neuroni se numără şi neuromelanina, produs de oxidare apărut în sinteza catecolaminelor. Fenomenul este mai răspândit la primate (Herrero et al. 1993).

        Modificări senescente ale citoscheletului şi ale matrixului extracelular

     Citoscheletul (sau scheletul celular) este alcătuit din filamente de natură proteică, dispuse într-o reţea tridimensională extinsă în citoplasmă şi având funcţia de a conferi celulei o formă optimă în diferitele ei etape de dezvoltare, de a crea condiţiile necesare schimbării  acestei forme şi de a permite deplasarea activă a organitelor celulare în citoplasmă. Citoscheletul pare a fi implicat, de asemenea, şi în numeroase alte procese ce au loc la nivelul celulei, printre care transmiterea mesajelor informaţionale, învăţarea şi memorizarea etc.

    Bacteriile nu dispun de citoschelet; el pare să existe numai în celulele eucariote.

    Scheletul celular este alcătuit din microfilamente de actină, microtubuli şi filamente intermediare.

    Microfilamentele de actină sunt formate din monomeri de actină globulară (G-actină) dispuşi în două şiruri liniare paralele, răsucite sub forma unei duble elice (figura 14).

                                                                            Fig.14 -  Arhitectura caracteristică a filamentelor de actină

 

     Filamentele de actină joacă un rol important în edificarea citoscheletului tuturor tipurilor de celule, îndeosebi prin realizarea în imediata vecinătate a membranei celulare a unei reţele bidimensionale sau tridimensionale. După cum se ştie, filamentele de actină reprezintă, de asemenea, un component fundamental al structurilor contractile din fibrele musculare. în reţelele de actină, lanţurile de F-actină (actină fibrilară) sunt interconectate prin legături intercatenare ('cross-links') realizate de aşa numiţii factori de gelaţie, printre care se numără gelactina, alfa-actinina, fascina, fimbrina şi mai ales filamina.

     Filamina este  un dimer format din două polipeptide identice legate  cap la cap, ale căror extremităţi sunt prevăzute cu câte un loc de legare pentru actină (figura 15). 

                                             Fig.15 - Realizarea reţelei tridimensionale actinice  prin  interconectarea filamentelor de actină

 

     Pe extremităţile libere ale filamentelor de actină se pot fixa, la un moment dat, anumite molecule proteice (capping proteins, fragmin, severin, accumentin, gelsolin, vilin etc.) care au tendinţa de a  separa filamentele de actină unele de altele şi de a opri creşterea lor în lungime, blocând ataşarea unor noi monomeri de actină globulară.

      Kim et al. (1992) arată că în celulele prelevate din corneea animalelor tinere, F-actina formează reţele cu ochiuri hexagonale, având forme de o regularitate remarcabilă. Pe măsura înaintării în vârstă, această reţea devine din ce în ce mai dezordonată.

     În eritrocite, citoscheletul format din F-actină se leagă de membrana celulară prin intermediul unor molecule de tipul spectrinei şi ankirinei. Spectrina formează o reţea bidimensională în care tetrameri de spectrină sunt interconectaţi cu ajutorul unor filamente foarte scurte de F-actină (figura 16). Moleculele de ankirină au relaţii strânse cu moleculele proteice din membrană, îndeosebi cu cele din aşa numita bandă 3.

  

 

                                                                  Fig.16 - Relaţii între membrana celulară şi reţeaua de spectrină

 

     În neuroni, rolul spectrinei din eritrocite este preluat de fodrina aflată în citoplasma perimembranară, unde leagă filamentele de actină cu membrana celulară. Printre altele, fodrina reglează şi numărul receptorilor pentru mediatorul chimic L-glutamat, fiind, astfel, implicată în procesele de învăţare şi memorizare. La rândul ei, fodrina este sub controlul unei proteaze, numită calpain I, care o degradează în anumite condiţii.

     Bahr et al. (1994) constată scăderea cu vârsta a concentraţiilor de actină, talină, ankirină şi spectrină în creierul şoarecilor, precum şi creşterea proteinei tau (o proteină de 63 kDa, mai cunoscută prin faptul că este implicată în apariţia împâslirilor neurofibrilare din neuronii senescenţi sau ai celor bolnavi de maladii degenerative de tip Alzheimer).

     Joncţiunea citoscheletului actinic cu membrana celulară  diferă de la celulă la celulă. La această legătură iau parte molecule de tipul vinculinei şi talinei precum şi alfa şi beta integrinele, care leagă reţeaua citoscheletală de receptorii fibronectinei aflaţi în membrană. Astfel, se asigură conexiunea citoscheletului cu matrixul extracelular, un rol de seamă avându-l în acest proces moleculele glicoproteice adezive de tipul fibronectinei care există sub formă de dimeri, oligomeri şi chiar sub formă de fibrile interconectate prin legături disulfidice (Horwitz et al., 1986) (figura 17)

    Fig.17 - Reprezentare schematică a relaţiilor dintre citoscheletul de actină, proteinele membranare şi fibronectina din matrixul extracelular

 

     Fibronectina este o proteină extracelulară care a fost izolată din preparatele de fibroblaşti cultivaţi in vitro. La celulele nevrogliale şi în cele ale ţesuturilor embrionare, rolul fibronectinei este preluat de tenascină, care există sub forma unui hexamer în care monomerii sunt dispuşi ca spiţele unei roţi.

     Implicarea în procesele de senescenţă a fibronectinei a atras atenţia unui număr relativ mare de cercetători. Martin et al. (1990) determină expresia genelor care codifică fibronectina în fibroblaşti, constatând că nivelul ARN-ului mesager pentru această proteină creşte în faza de senescenţă clonală a culturilor de fibroblaşti.

      La acelaşi rezultat ajung şi Kumazaki (1992) şi Kumazaki et al. (1993), care îmbogăţesc această informaţie, arătând că un fenomen similar se petrece nu numai în cazul fibroblaştilor care îmbătrânesc clonal in vitro ci şi în cazul fibroblaştilor recoltaţi de la donori vârstnici. 

     Studiind prin tehnici imunocitochimice nivelul fibronectinei în membranele bazale ale diferitelor celule, Vitellaro-Zuccarello et al. (1992) constată că fibronectina apare sub formă de conglomerate dispuse într-o manieră discontinuă de-a lungul fibrelor de colagen iar concentraţia ei manifestă o tendinţă de scădere cu vârsta, cel puţin în dermul reticular.

     Rasoamanantena et al. (1993) constată un nivel crescut al biosintezei de fibronectină în fibroblastele senescente umane cultivate in vitro. In schimb, Takasaki et al. (1994) observă că în aorta şobolanilor nu se înregistrează creşteri cu vârsta a concentraţiei  de fibronectină.

     Microtubulii sunt formaţi din monomeri de tubulină dispuşi în şiruri strâns spiralate formând cilindri cu diametrul exterior de 24 nm şi diametrul interior de 14 nm (figura 18). La formarea microtubulilor participă şi numeroase alte tipuri de proteine de care depinde stabilitatea în timp şi solubilitatea în diferiţi solvenţi ale acestor structuri dinamice citoscheletale, implicate mai ales în diviziunea celulară. Există substanţe de tipul colchicinei care împiedică polimerizarea tubulinei şi, ca o consecinţă, suprimă diviziunea celulară.

Fig.18 - Reprezentare schematică a microtubulilor

 

     Fifkova & Morales (1992) studiază variaţia în cursul senescenţei a raportului dintre tubulină şi alfa-tubulina acetilată şi constată o creştere a acestui raport pe măsură ce şobolanii, utilizaţi ca animale de experienţă, îmbătrânesc.

     Filamentele intermediare sunt mai groase decât filamentele de actină dar mai subţiri decât microtubulii.

     Există mai multe tipuri de filamente intermediare. în tipul I predomină keratina, în tipul II există multă vimentină (în creier) şi desmină (în muşchi, unde leagă liniile Z ale miofibrilelor vecine). Tipul III de filamente intermediare este reprezentat de neurofilamente iar tipul IV, de proteine din lamina nucleară.

     Proteinele care alcătuiesc filamentele intermediare sunt foarte rezistente, stabile şi insolubile în majoritatea solvenţilor. Ele formează o reţea densă în jurul nucleului, radiind către periferia celulei. Monomerii acestor proteine au o regiune centrală care conţine 310 reziduri de amino-acizi dispuşi într-un alfa-helix (porţiunile colorate în negru din fig.19), întrerupt, însă, de trei zone înguste non-alfa-helix. Regiunea centrală se continuă prin două extremităţi mai lungi sau mai scurte, în funcţie de tipul proteinei.

     Aceste proteine pot exista ca monomeri, ca dimeri, ca tetrameri (protofilamente) sau ca filamente groase de 10 nm alcătuite din 8 protofilamente (adică din 32 de lanţuri polipeptidice) (fig.19).

 Fig.19 - Reprezentare schematică a structurii filamentelor intermediare

 

     Rolul jucat de filamentele intermediare pare a fi pur mecanic, deoarece experienţele au arătat că celula poate supravieţui şi în lipsa lor. Filamentele intermediare pot alcătui reţele tridimensionale datorită unor molecule de tipul plectinei care realizează legături intercatenare (Wiche et al., 1993).

     Există relativ puţine lucrări ce descriu participarea filamentelor intermediare în procesul de senescenţă celulară. într-una dintre acestea, Ward et al. (1992) studiază prin tehnici imunohistochimice modificarea cu vârsta a expresia vimentinei în rinichiul şobolanilor de diferite vârste, precum şi în rinichii unor oameni de diferite vârste. Autorii citaţi constată că la embrioni, la nou născuţi şi la adulţi tineri de şobolani, vimentina nu este exprimată în tubulii renali corticali. Ea nu există nici în rinichii copiilor sub doi ani. în schimb, la vârstnici, vimentina există din abundenţă. Autorii numesc trecerea celulei din stadiul în care nu exprimă vimentină în cel în care vimentina îşi face apariţia în citoplasmă, metaplazie de vimentină.

     Matrixul extracelular (ME) este o reţea de macromolecule secretate de celule. El asigură asocierea celulelor în vederea formării de  ţesuturi şi organe, permiţând, totodată, migrarea ordonată a celulelor în procesele de creştere şi de dezvoltare.

     În multe cazuri, asocierea celulelor se face nemijlocit, prin conexiuni intercelulare, aşa cum se întâmplă cu celulele epiteliale care realizează între ele joncţiuni strânse. Cel mai adesea, însă, legăturile dintre celule se realizează prin intermediul matrixului extracelular.

     Kantorova (1994) descrie matrixul extracelular ca o structură complexă supramoleculară, alcătuită din colagen polimerizat, elastină, proteoglicani şi glicoproteine structurale. Este de remarcat feed-back-ul permanent dintre matrix şi celulele conjunctive precum şi existenţa unor relaţii structurale şi funcţionale între membranele bazale, matrixul extracelular şi pericelular şi citoschelet, relaţii în care un rol important revine integrinelor transmembranare.

     În matrixul extracelular se află cel puţin 11 tipuri de colagen, 8 - 10 tipuri de proteoglicani, peste 12 tipuri de glicoproteine structurale precum şi elastină (Robert, 1986). Macromoleculele care intră în alcătuirea matrixului extracelular pot fi clasificate în două categorii. Prima categorie este reprezentată de proteine fibroase care pot fi structurale (colagen şi elastină) şi adezive (fibronectină, laminină). în cea de a doua categorie intră glicozaminoglicanii (GAG) (acid hialuronic, condroitin-sulfat, heparan-sulfat, keratan-sulfat, heparină etc.).

     Moleculele de glicozaminoglicani se caracterizează prin numeroasele lor sarcini negative care atrag ionii de sodiu puternic  hidrataţi  asigurând, prin cantitatea mare de apă reţinută, atât turgorul caracteristic tesuturilor cât şi o mare rezistenţă la compresiune mecanică. GAG formează împreună cu proteinele aşa numiţii proteoglicani. De fapt, GAG se inseră de-a lungul lanţurilor polipeptidice, la distanţe de 10-20 nm unii de alţii, perpendicular pe axa longitidinală a lanţului (figura 20).

 

                                                            Fig. 20 - Reprezentare schematică a structurii moleculare a proteoglicanilor

 

 

     Spre deosebire de oligozaharidele ramificate care intră în componenţa glicoproteinelor, glicozaminoglicanii nu sunt ramificaţi.

      Roughley & Lee (1994) fac o amănunţită descriere a celor 5 proteoglicani din matricea extracelulară a cartilajului hialin. Cel mai mare dintre proteoglicani este agrecanul, care are peste 100 de lanţuri de condroitin-sulfat şi keratan-sulfat. El interacţionează cu acidul hialuronic pentru a realiza agregate mari de proteoglicani. Pentru a-şi îndeplini această funcţie legată de proprietăţile osmotice ale cartilajului, agrecanul este prevăzut cu numeroase sarcini negative furnizate de lanţurile de glicoaminoglicani. Printre ceilalţi proteoglicani, a căror menire este de a interacţiona cu colagenul, se numără decorinul (prevăzut cu un lanţ de dermatan-sulfat), biglicanul (cu două lanţuri de dermatan-sulfat) şi fibromodulina. Decorinul şi fibromodulina interacţionează cu colagenul tip II din matrix şi, împreună, pot juca un rol important în fibrilogeneza acestuia şi în interacţiunile interfibrilare. Biglicanul se află în matrixul pericelular unde interacţionează cu colagenul tip IV. Autorii apreciază că chiar şi colagenul tip IX poate fi considerat un proteoglican de vreme ce poate purta un lanţ de glicozaminoglican.   

     Gelurile de proteoglicani joacă un rol mai mult sau mai puţin important în controlul difuziei micromoleculelor şi ionilor în spaţiul extracelular precum şi în schimburile de substanţă între celule şi mediul extracelular. Acest lucru este evident în ţesuturile conjunctive avasculare cum sunt cartilajele, discurile intervertebrale, corneea etc., unde dificultăţile de oxigenare sunt cu atât mai mari cu cât căile de difuzie sunt mai lungi (situaţie întâlnită în cazul structurilor nevascularizate de mari dimensiuni aparţinând organismelor de talie mare). Situaţia oxigenării în aceste ţesuturi depinde şi de vârsta organismului şi poate fi apreciată, după Scott (1992), pe baza  raportului cantitativ dintre două componente ale matrixului şi anume, condroitin-sulfat (a cărui sinteză necesită mult oxigen) şi keratan-sulfat, mai puţin pretenţios din acest punct de vedere.

     O formă specială a matrixului extracelular este aşa numita membrană bazală (sau lamina bazală) a celulelor.

     Membrana bazală poate înveli întreaga celulă, alăturându-se membranei celulare pe toată suprafaţa acesteia, aşa cum se întâmplă în cazul celulelor musculare, adipoase sau al celulelor Schwann. în alte cazuri, membrana bazală realizează un strat continuu pe care sunt aşezate celulele care intră în contact cu ea numai printr-o regiune limitată a membranei lor celulare (epitelii, endotelii etc.). (figura 21)

 

 

     Fig. 21 - Reprezentări schematice ale membranei bazale într-o secţiune prin piele: 1-celule epiteliale; 2-membrana bazală; 3-macrofag; 4- fibroblast; 5-glicosaminoglicani; 6-fibre de colagen; 7-capilare; 8-fibre elastice; 9-adipocit

 

      Membrana bazală este formată din lamina lucida (care este un strat transparent pentru electroni) ce aderă la membrana celulară, lamina densa, care este o reţea densă bogată în colagen de tip IV şi mărginită pe ambele feţe de straturi formate de proteoglicani (mai ales heparan-sulfat) şi glicoproteine (laminin şi entactin) şi, în sfârşit, lamina reticulata, care leagă membrana bazală de ţesutul conjunctiv. Cel mai bine definite glicoproteine ale membranei bazale sunt cele de laminin care au o formă de cruce (figura 22), fiind alcătuite dintr-un lanţ A şi două lanţuri B. Această configuraţie permite lamininei să stabilească, în acelaşi timp, legături cu moleculele de colagen IV, cu receptorii de laminină de pe suprafaţa celulei precum şi cu moleculele de heparan-sulfat. 

     Fig.22 - Reprezentare schematică a structurii şi a formei principalelor molecule ce intră în compoziţia matrixului extracelular

 

     Matrixul extracelular, în general, şi membrana bazală, în special, joacă roluri importante pentru structura şi funcţia celulelor cu care se află în contact. Rune et al. (1992) cultivă celule Sertoli pe diferite matrixuri extracelulare şi constată că gradul de diferenţiere celulară, forma şi ultrastructura acestor celule au de câştigat dacă matrixul este bogat în laminină, în comparaţie cu situaţiile în care matrixul este îmbogăţit în special cu colagen, fibronectină sau sulfat de heparan.

     Odată cu trecerea timpului, apar tot mai numeroase semne de senescenţă a matrixului extracelular.

     După cum afirmă Robert (1993) declinul cel mai rapid cu vârsta îl marchează ţesuturile elastice  (vasele, plămânii, pielea etc.) care au mult matrix extracelular în structura lor. La nivelul acestor organe, sunt afectate atât celulele (care s-ar apropie de limita Hayflik a diviziunilor permise) cât şi fibrele matrixului angajate în legături intercatenare, atacate de radicalii liberi sau degradate proteolitic.

     În procesul de senescenţă se constată adesea îngroşarea membranelor bazale. Curri (1986) observă acest fenomen în cazul membranelor bazale de la nivelul vaselor sangvine foarte mici şi pune acest proces pe seama creşterii masive a cantităţii de proteoglicani. După acest autor, microvasele arteriale, venoase şi limfatice formează, împreună cu substanţa bazală a ţesutului conjunctiv în care sunt incorporate, adevărate unităţi funcţionale. Henry et al. (1992) notează apariţia, odată cu înaintarea în vârstă, a unor adevărate 'gulere' bogate în colagen dispuse în jurul micilor vase de sânge din timus. Aceste structuri par a controla schimburile de molecule şi ioni la nivelul capilarelor din timus, comportându-se ca adevărate 'bariere hemato-timice' (după cum se exprimă autorii).

     Cartilajele bătrâne se remarcă, după Vilim & Fosang (1994), prin cantităţi scăzute de decorin şi biglican precum şi prin cantităţi importante de fragmente de agrecan trunchiat .

     La şoarecii cu senescenţă accelerată (SAM - un model recent pentru studiul senescenţei la rozătoare) creşte grosimea membranelor bazale iar dispoziţia fibrelor de colagen capătă un aspect dezordonat.

     În pielea celor trecuţi de 60 de ani apar alterări cantitative şi calitative ale glicozicanilor, în special ale acidului hialuronic şi dermatan-sulfatului. Scăderea concentraţiei de acid hialuronic este cauza scăderii turgidităţii, a apariţiei ridurilor şi a pierderii elasticităţii pielii (Gersetich et al., 1994).

     Meyer & Stern (1994) vorbesc despre hialuronan ca despre un component major al matrixului extracelular din piele, implicat în reţinerea unor cantităţi importante de apă la persoanele tinere. Autorii constată cu oarecare surpriză că  nici concentraţia şi nici mărimea moleculei de polimer nu se modifică cu vârsta, deşi remarcă asocieri mai puternice cu structurile celulare.

     Ichihara et al. (1993) constată creşterea volumului ocupat de fibrele de colagen în matrixul extracelular din testicolul şobolanilor de vârste înaintate, ca şi în membrana bazală din pereţii vaselor de sânge ale acestor animale. Takada et al. (1993) studiază liniile de şoareci caracterizate de o senescenţă accelerată şi observă că în membrana bazală a capilarelor acestora  distanţa dintre fibrele de colagen creşte ca urmare a apariţiei în jurul acestora a unor fibrile foarte fine, tot de colagen. Ca urmare, membrana bazală a capilarelor  se îngroaşă mult. De Jong et al. (1992), studiind cu ajutorul microscopului electronic secţiuni din creierul şobolanilor bătrâni, constată două tipuri de modificări în membrana bazală, sub forma apariţiei la acest nivel a unor incluziuni membranoase precum şi sub forma fibrozei şi a îngroşării membranei bazale. Autorii citaţi constată că la şobolanii foarte vârstnici, fibrele de colagen încep să se depolimerizeze iar fibroza membranei bazale face loc treptat  îngroşării acesteia. Fornieri et al. (1992) constată şi ei producerea unei fibroze progresive la nivelul matrixului extracelular din pereţii aortei de şobolan, fibroză asociată cu modificări ale fibrelor elastice. Radner et al. (1994) remarcă îngroşarea cu vârsta a membranei bazale glomerulare, datorită acumulării de colagen.

    Modificări senescente ale colagenului şi elastinei din matrixul extracelular şi din ţesutul conjunctiv

     Colagenul reprezintă un sfert din cantitatea totală de proteine a mamiferelor şi 5% din masa lor corporală. Moleculele de colagen sunt secretate de fibroblaste, sub forma unor alfa-lanţuri; trei asemenea alfa-lanţuri se răsucesc unele în jurul celorlalte pentru a forma o moleculă de colagen de circa 300 nm lungime şi 1,5 nm grosime, moleculă caracterizată printr-o structură rigidă de tip triplu helix.

     Structura primară a colagenului scoate în evidenţă prezenţa rezidului glicinei, care reprezintă fiecare al treilea reziduu amino-acidic, schema structurii primare putând fi scrisă astfel: Glicină - aa - aa -  Glicină - aa - aa - Glicină - aa - .. etc.  în acest context, devine evident de ce substituirea glicinei cu un alt amino-acid poate avea efecte catastrofale asupra structurii triplului helix (mai ales dacă amino-acidul substituent este cisteina, capabilă să genereze legături disulfidice). Poziţiile celorlalţi aminoacizi pot fi ocupate de numeroase tipuri de reziduri de aminoacizi. O proporţie neobişnuit de mare aparţine, însă, prolinei    (12,5%) şi    hidroxiprolinei (10 %). De altfel, hidroxiprolina este un amino-acid care poate fi întâlnit numai în colagen, astfel încât măsurarea cantităţii totale de colagen dintr-un ţesut se poate face determinând nivelul hidroxiprolinei în acel ţesut.

     Se cunosc astăzi peste 20 de tipuri de lanţuri polipeptidice de colagen, fiecare fiind codificat de o genă bine definită. Aceste lanţuri sunt notate prin simbolurile 1(I), (II), 1(III) etc., 2(I), 2(II), 2(III) etc., 3(III), etc.

     Moleculele de colagen se realizează prin răsucirea sub formă de triplu helix a 3 -lanţuri de colagen . Deşi, teoretic, există peste 1000 de posibilităţi de combinare câte trei  a -lanţurilor, se cunosc numai circa 10 tipuri de molecule de colagen dintre care mai răspândite sunt :

     Tipul I : 1(I)-1(I)-2(I), aflat în piele, oase, tendoane sub formă fibrilară

     Tipul II  1(II)-1(II)-1(II),  aflat sub formă fibrilară în cartilaje, discuri intervertebrale, corpul vitros al ochiului etc.

     Tipul III  1(III)-1(III)-1(III), aflat în piele, vase, organe interne sub formă de fibre

     Tipul IV  1(IV)-1(IV)-2(IV), care formează o reţea poligonală în membrana bazală.

     Interesant este faptul că în genele care codifică -lanţurile şi care au circa 30-40 kilobaze sunt intercalaţi 50 de introni (regiuni care nu codifică proteine) care reprezintă 70%-90% din numărul total de nucleotide. Cei 50 de exoni (care codifică -lanţuri) sunt alcătuiţi fiecare din 54 de nucleotide sau dintr-un număr ce este multiplu exact al valorii de 54, ca şi cum ar fi vorba de o reduplicare multiplă a unei gene primordiale alcătuită din 54 de nucleotide. Fapt este că există mari asemănări între colagenul extras de la vieţuitoare aparţinând unor specii foarte puţin înrudite. Astfel, Guo et al. (1991), prezintă comparativ secvenţa amino-acizilor în două lanţuri similare de colagen, unul aparţinând omului iar celălalt provenind de la nematodul Caenorhabditis elegans, subliniind asemănările dintre ele.

     Alfa-lanţurile de colagen se sintetizează la nivelul unor ribozomi legaţi de membrana reticulului endoplasmic şi sunt injectaţi, apoi, în lumenul acestuia sub formă de precursori sau pro--lanţuri care se deosebesc de -lanţuri prin faptul că au la extremităţi amino-acizi suplimentari sub forma unor propeptide. în lumenul reticulului endoplasmic are loc hidroxilarea prolinei şi lizinei, care devin hidroxiprolină şi hidroxilizină. Pro--lanţurile se combină trei câte trei, dând naştere unor molecule de procolagen, care părăsesc fibroblastul şi îşi fac apariţia în mediul extracelular, unde pierd propeptidele (excepţie face tipul IV de colagen care nu şi le pierde), devenind, în sfârşit, molecule de colagen (fig. 23). 

                                                                             Fig. 23 - Reprezentare schematică a sintezei colagenului

     Moleculele de colagen au tendinţa de a se asocia în structuri fibrilare. Molecula unică de colagen formată din trei lanţuri poartă numele de tropocolagen şi are un diametru de 1,5 nm. Moleculele de tropocolagen se asociază în fibre de colagen cu diametrul cuprins între 10 şi 300 de nanometri.

     Deşi colagenul este degradat încet dar continuu de colagenaze, turnoverul său este foarte lent; moleculele de colagen rămân ca atare în ţesuturi timp de zeci de ani (spre deosebire de cele mai multe proteine celulare care au un timp de înjumătăţire de ordinul zilelor sau chiar al orelor).

     Odată formate, fibrele de colagen sunt întărite prin legături covalente la nivelul rezidurilor lizinice aparţinând aceluiaşi lanţ sau unor lanţuri diferite. Aceste legături intercatenare (“cross links”) se adaugă legăturilor de hidrogen care asigură structura de triplu helix.

     Efectele trecerii timpului asupra colagenului se manifestă sub aspect cantitativ şi calitativ.

     Modificări cantitative ale colagenului din ţesuturi senescente. Din punct de vedere cantitativ, se observă modificări ale cantităţii totale de colagen raportată la masa fragmentului de ţesut investigat; au loc, de asemenea, modificări, odată cu înaintarea în vârstă, ale raportului dintre cantităţile reprezentate de diferitele tipuri de colagen.

     Oikarinen (1994) arată că proteina colagen reprezintă 70%-80% din greutatea pielii uscate. Odată cu vârsta, sinteza de colagen în piele scade, la fel ca şi grosimea pielii (în special după 70 de ani).

     Castelo-Branco et al. (1992) arată că în pielea femeilor având vârste mai mari de 40 de ani se remarcă o scădere progresivă a cantităţii de colagen. Vitarello-Zuccarello et al. (1994) constată că densitatea fibrelor de colagen din piele creşte cu vârsta până la 40 de ani, după care scade. în alte ţesuturi, însă, colagenul se acumulează cu vârsta, aşa cum se petrece cu discurile intervertebrale la om (Olczyk, 1992). în unele ţesuturi, cantitatea de colagen ajunge, chiar, să se tripleze la vârste înaintate (Velican & Velican, 1970).

     Scăderea cantităţii totale de colagen din piele poate avea drept cauză fie reducerea ratei sintezei colagenului, fie creşterea ritmului de distrugere a colagenului prin atacul colagenazei.

     Experienţe cu amino-acizi marcaţi radioactiv arată că incorporarea acestora în colagen nu mai are loc la şobolanii având vârste mai mari de 2 ani, semn că, odată cu înaintarea în vârstă, biosinteza de colagen încetează. Reishner & Menzel (1994) arată că incorporarea unor aminoacizi în tendon este mai mare la tineri decât la bătrâni.

     Studiile realizate asupra expresiei colagenului în principala celulă care îl fabrică, fibroblastul, arată că, odată cu senescenţa clonală a fibroblastului cultivat in vitro, expresia colagenului scade, cu deosebire cea a colagenului de tip I. Mai mult încă, o bună parte a moleculelor de colagen sintetizate este degradată încă înainte de trecerea moleculelor de colagen în spaţiul extracelular (Martin et al.,1990). Există multe nepotriviri între datele prezentate în diferite lucrări, cu privire la acest aspect. Astfel, dacă Martin et al. (1990) afirmă că nivelul m-ARN pentru colagenul I scade în fibroblastele bătrâne (spre deosebire de m-RNA pentru colagenul III care creşte, fapt constatat şi de Vitellaro-Zuccarello et al. 1992), datele publicate de Peleg et al. (1993) arată că în fibroblastele recoltate de la şobolanii bătrâni, m-ARN pentru colagenul I creşte. Analizând în detaliu afirmaţia conform căreia raportul  colagen III/colagen I scade cu vârsta, Mays et al. (1988) spun că acest lucru este adevărat în unele ţesuturi (piele) dar nu în altele (inimă şi plămâni).

     După Brinckmann et al. (1994), referitor la colagenul sintetizat de fibroblaşti recoltaţi de la oameni tineri şi de la oameni bătrâni, nu există nici o diferenţă privind raportul dintre colagenul III şi colagenul I şi nici între nivelul hidroxilării unor aminoacizi. Se pare că fibroblaştii menţin toată viaţa un nivel constant al sintezei de colagen, din toate punctele de vedere.

     Dimpotrivă, Dumas et al. (1994) ajung la concluzii diferite: biosinteza de colagen realizată de fibroblaşti prelevaţi de la tineri şi de la bătrâni scade cu vârsta (pentru colagenul I şi pentru colagenul III, cu 29% după vârsta de 49 de ani).

     Kovanen & Suominen (1989) studiază colagenul din muşchi şi constată o participare mai marcată a colagenului de tip I în procesele senescente, deoarece concentraţia acestui tip de colagen creşte cu vârsta în dauna colagenului de tip III. Tot ei arată că, în general, rata biosintezei de colagen scade cu vârsta dar această scădere este mai mică în muşchii lenţi supuşi unui antrenament fizic de lungă durată. Şi Goldspink et al. (1994) arată că îmbătrânirea duce la scăderea expresiei colagenului în muşchi; după ei, creşterea fibrozei musculare cu vârsta nu este rezultatul expresiei genei colagenului ci, mai curând, o diminuare sau o alterare a degradării colagenului.

      Fedarko et al. (1992) arată că nivelul colagenului creşte odată cu vârsta donorului, atingând un maxim la vârsta pubertăţii, după care scade, începând cu vârsta de 20 de ani, la o treime din nivelul iniţial.

 

     Modificări senescente mecanice şi termodinamice ale colagenului. Schimbările calitative ale colagenului provocate de trecerea timpului se reflectă, printre altele, în proprietăţile mecanice şi termodinamice ale ţesutului conjunctiv fibros. Cele mai multe experienţe de acest tip, iniţiate de F.Verzar, au utilizat ca model biologic tendonul din coada şobolanilor de diferite vârste. S-a constatat că fibrele de colagen au tendinţa generală de a se contracta prin încălzire. Un fragment de tendon recoltat de la un şobolan tânăr, fragment încălzit la 58°C, se scurtează cu un sfert din lungimea sa; dacă, deşi încălzit, este împiedicat să se scurteze, tendonul dezvoltă o anumită forţă de contracţie.

      S-a constatat că forţa necesară pentru a bloca 50% din scurtarea tendonului unui şobolan de 18 luni este de 3,9 ori mai mare decât cea necesară în cazul unui şobolan de 3 luni.

     Tendonul cozii unui şobolan de de 5 luni se scurtează cu 20% la temperatura de 58°C şi într-un interval de 7 minute. La un şobolan în vârstă de 24 de luni, scurtarea atinge 70% la aceeaşi temperatură şi în acelaşi interval de timp (Verzar F., Gerontologia, 1964, 9, 209-221, citat în Velican & Velican, 1970).

     Devine, astfel, posibil să se determine vârsta biologică a tendonului din coada de şobolan prin diferite metode, cum ar fi:

     - măsurarea forţei necesare pentru a împiedica scurtarea în urma unei încălziri progresive controlate

     - determinarea temperaturii la care începe contracţia şi a celei la care contracţia este maximă

     - determinarea temperaturii la care fibrele încep să se rupă în situaţia în care este împiedicată scurtarea

     - măsurarea perioadei de timp necesară apariţiei relaxării după contracţia maximă

     - determinarea cantităţii de hidroxiprolină care este eliberată în cursul procesului de contracţie termică

     În ceea ce priveşte acest ultim tip de experiment, cercetările efectuate de Verzar F. şi N.Mayer, Gerontologia, 1961, 5, 163 (citat de Velican & Velican, 1970) arată că prin contracţia termică a tendonului unui şobolan în vârstă de 30 - 60 de luni se elimină doar 25% din hidroxiprolina totală, spre deosebire de procentul de 75 - 90 constat în cazul şobolanilor în vârstă de 1 - 3 luni.

     Woo et al. (1986) supun la teste mecanice ligamente prelevate de la iepuri de diferite vârste şi constată o creştere semnificativă a tensiunii de rupere ca rezultat al maturizării şi al îmbătrânirii colagenului. Tot odată, are loc şi creşterea cu vârsta a ariei suprafeţei de histerezis a ciclului întindere-relaxare.

     Dacă proprietăţile mecanice ale colagenului se schimbă mult odată cu înaintarea în vârstă în cazul şobolanilor, iepurilor şi al altor mamifere de mici dimensiuni, nu acelaşi lucru  pare să se petreacă în cazul omului. Hubbard et al. (1984) prelevează fragmente de tendon de la 44 de persoane cu vârste cuprinse între 16 şi 88 de ani şi supune aceste fragmente unor stress-uri mecanice de tipul extensiei continue sau ciclice. Rezultatele lor arată că vârsta subiectului nu are vreun efect asupra modulului de elasticitate al tendonului iar efectul vârstei asupra relaxării după stress şi asupra fenomenului de histerezis în ciclul stress-relaxare este mic. Autorii îşi iau precauţia de a afirma că este posibil ca aceste efecte să existe, totuşi, dar să fie mascate de alte efecte legate de modul de alimentaţie, antrenamentul şi de starea generală de sănătate a persoanelor investigate. Johnson et al. (1994) studiază proprietăţile vâscoelastice ale tendonului rotulian fără a constata modificări importante odată cu înaintarea în vârstă.

 

     Angajarea colagenului senescent în glicosilare şi interconectare. Modificările care survin în proprietăţile mecano-termodinamice ale colagenului odată cu înaintarea în vârstă se explică, de regulă, prin două procese chimice :

- apariţia unor legături covalente între segmente diferite ale aceluiaşi lanţ de colagen sau între lanţuri diferite de colagen (numite legături intercatenare, legături transversale  sau “cross-links”).

- ataşarea la lanţul de colagen a unor molecule hidrocarbonate (glicare sau glicosilare), urmată, uneori, de interconectarea lanţurilor

      În ceea ce priveşte glicarea, ea se realizează, în principiu, printr-o legătură intervenită între un reziduu de amino-acid şi un hidrocarbonat, în urma unei reacţii necontrolate enzimatic, în care grupul carbonil al glucozei condensează direct cu rezidul de amino-acid. Expunerea îndelungată a colagenului din ţesuturi la  glucoza existentă în plasma sangvină favorizează formarea şi acumularea unor produşi finali ai glicării avansate (PFGA) care sunt molecule reactive ce pot ataca molecule de importanţă fundamentală cum sunt ADN, colagen, molecule din teaca de mielină etc. (Sensi et al.,1991).

     Atât îmbătrânirea cât şi diabetul zaharat sunt însoţite de o creştere a intenstăţii radiaţiei fluorescente  de 430 nm emisă de colagen ca urmare a iradierii acestuia cu radiaţii ultraviolete având lungimea de undă egală cu 370 nm (Miksik et al., 1991). Acest fenomen are loc şi în urma incubării in vitro a colagenului cu glucoză (dar şi cu alte hidrocarbonate cum sunt fructoza, galactoza, riboza, tetroze, trioze etc). Monnier et al. (1988) administrează şobolanilor o dietă conţinând 33% galactoză. După 3 luni nu se observă încă nici o modificare dar după 12 luni, în condiţiile acestui regim de alimentaţie, timpul de rupere al tendonului (“breaking time”) în uree se dublează şi îşi fac apariţia fluorofori, care emit radiţii cu lungimea de undă de 430 nm dacă sunt excitaţi cu radiaţii ultraviolete având lungimea de undă de 355 nm. Autorii pun fluorescenţa observată pe seama glicosilării neenzimatice a colagenului (sau a reacţiei Maillard avansate).

     Tanaka et al. (1988) utilizează, în experienţele lor de glicare a colagenului, riboza, care are avantajul de a reacţiona mai rapid cu proteinele decât glucoza sau gliceraldehida. Glicarea realizată duce la expansiunea cu peste 12% a unităţii care descrie structura tridimensionalăa colagenului, expansiune care are loc pe o direcţie perpendiculară pe axa longitudinală a moleculei de colagen.

     Naresh & Brodsky (1992) confirmă creşterea nivelului de produşi ai reacţiei Maillard în urma glicosilării neenzimatice, dar face aceasta cu ajutorul tehnicii de difracţie a razelor X.

     Dyer et al. (1993) studiază variaţia cu vârsta a produsului iniţial de glicare, şi anume, fructozo-lizina, constatând că nivelul acesteia creşte cu 33% în pielea omului de 85 de ani în comparaţie cu nivelul ei în pielea  unui tânăr de 20 de ani. în schimb, carboximetil-lizina şi pentozidina, care apar prin reacţii Maillard târzii cresc  de 5 ori de-a lungul aceluiaşi interval şi tot de 5 ori creşte şi intensitatea fluorescenţei legate de colagen.

     MacDonald et al. (1992), cercetând produşii finali ai glicosilării avansate în artera mezenterică a unor oameni având vârste cuprinse între 29 şi 82 de ani, demonstrează o relaţie clară între vârstă şi nivelul fluorescenţei legate de colagen.

     Modificările datorate glicării sunt deosebit de evidente în discurile intervertebrale ale vârstnicilor, discuri care devin galbene-brune. Numeroşi autorii aduc dovezi legate de faptul că atât cromoforii cât şi fluoroforii identificaţi în acest ţesut sunt produşi ai glicării. într-adevăr, aşa cum arată Iguchi et al. (1993), glucoza formează cu proteinele, pe cale neenzimatică, produşi Amadori care se deshidratează şi se rearanjează pentru a deveni PFGA, care sunt bruni, fluorescenţi şi care, în contrast cu produşii Amadori, sunt ireversibili şi se acumulează în colagen şi în alte proteine cu turnover lent.

     Sell et al. (1991) cercetează natura chimică a cromoforilor legaţi de colagenul oamenilor bătrâni; ei identifică un cromofor cu un mare grad de fluorescenţă şi anume, imidazol-[4,5-b]-piridina, care este un produs final al glicosilării avansate ce rezultă din reacţia unor pentoze cu arginina şi lizina proteinelor şi pe care l-au numit pentozidină. Dar şi glucoza poate da naştere pentozidinei, după o prealabilă fragmentare a hexozei. Pentoza care stă la baza formării pentozidinei poate proveni şi din trioze, tetroze şi ketoze prin condensare sau prin alte reacţii. Mecanismul formării pentozidinei implică deshidratarea unui compus Amadori derivat din pentoză, compus care este atacat de gruparea guanin a argininei. Acest proces nu este posibil în lipsa oxigenului.

     În ceea ce priveşte locurile preferate pentru glicosilare, acestea sunt, în special, rezidurile de lizină ale moleculei de colagen. Reisser et al. (1992) studiază lanţul de colagen tip I 2 CB 3-5 şi identifică 18 resturi de lizină şi un rest de hidroxilizină pe care se fixează moleculele de glucoză. Dintre acestea, însă, trei reziduri de lizină (Liz-453, Liz-479 şi Liz-924) reţin peste 80% din glucoza fixată pe polipeptidul colagenic. Distribuţia siturilor de fixare a glucozei diferă în funcţie de vârsta animalului de experienţă. Autorii ajung la concluzia că locurile de fixare a glucozei de-a lungul lanţului polipeptidic depind decisiv de structura primară a acestuia dar că preferinţa glucozei pentru unele sau pentru altele dintre aceste locuri potenţiale de fixare depinde şi de structurile de ordin superior ale proteinei.

     Celălalt fenomen care are consecinţe importante asupra modificării proprietăţilor fizico-chimice ale moleculelor de colagen este apariţia legăturilor intercatenare ('cross-links').

     În general, legăturile intercatenare pot fi asigurate de o multitudine de molecule, cu condiţia ca aceste molecule să dispună de o grupare aldehidică şi un grup formil terminal, să fie marcate de o substituţie care să atragă electroni la nivelul carbonilor (din grupul carbonil sau C-C), să aibă în componenţa lor atomi care să fie legaţi de un lanţ alifatic care să nu posede mai mult de 1-2 atomi de carbon adiţionali. Aceste condiţii au fost enunţate de Milch R.A, Gerontologia, 1963, 7, 129-152 (citat în Velican & Velican, 1970) care încheie şirul condiţiilor prezentate afirmând că agentul de legare trebuie să fie nu mai mare de 7 A pentru a putea încăpea în spaţiul dintre lanţurile de colagen şi că trebuie să dispună de un hidrogen terminal. Printre posibilii agenţi de legare se numără aldehidele glicerică, piruvică, glicolică, crotonică, acroleina, derivaţi dialdehidici, chinone etc.

     Numărul de legături intercatenare creşte mult atunci când colagenul este tratat cu ioni de ascorbat de cupru (Kano et al.,1987). Autorii arată că analiza prin electroforeză  a acestui tip de colagen dezvăluie multe asemănări cu cele petrecute în cursul senescenţei naturale a colagenului.

     Legăturile intercatenare apar, în mod normal, încă din primele faze ale existenţei moleculei de colagen, sub forma legăturilor divalente reductibile de tip aldimină şi oxoimină sau dihidroxilizinonor-leucina (Reiser et al., 1995). Ajuns la maturitate, colagenul se caracterizează prin creşterea progresivă în timp a legăturilor intercatenare (“cross links”) multivalente ireductibile. Barnard et al. (1987) izolează un amino-acid derivat din lizină şi prezent numai în colagenul matur, amino-acid a cărui concentraţie creşte monoton cu vârsta atât în piele cât şi în oase. Autorii afirmă că acest produs (insuficient caracterizat la data apariţiei articolului), este cel care asigură majoritatea legăturilor intercatenare în colagenul matur.

     Yamauchi et al. (1988) identifică natura produsului care asigură legăturile intercatenare în colagen, ca fiind  histidino-hidroxilizin-norleucina. Numărul acestor molecule creşte, începând de la naştere şi până la vârsta matură, atât în pielea de om cât şi în cea a bovinelor. Treptat, creşterea este din ce în ce mai lentă, concentraţia produsului ajungând totuşi la 1 mol/mol de colagen. Concentraţia acestui produs este direct proporţională cu valoarea raportului dintre colagenul insolubil şi cel solubil din ţesutul investigat. Substanţa mai sus menţionată lipseşte, însă, din colagenul altor ţesuturi, cum ar fi tendonul, dentina sau osul. în oase şi cartilaje, legăturile intercatenare sunt asigurate de hidroxipiridină. Concentraţia acestor forme mature de legături intercatenare atinge un maxim la vârsta de 10 - 15 ani, după care nivelul lor rămâne constant în viaţa adultă. Concentraţia hidroxipiridinei este de 5 - 10 ori mai mare în cartilaj, în comparaţie cu osul. în ceea ce priveşte raportul dintre nivelurile celor două forme de legături încrucişate mature caracteristice colagenului din os şi cartilaj, adică raportul hidroxilizil-piridinolină / lizil-piridinolină, acesta este 3,5/1 în os şi 10/1 în cartilaj (Eyre et al., 1988). Pe măsură ce formele mature ireductibile de legături încrucişate cresc numeric în procesul de maturizare, cele reductibile  scad treptat între momentul naşterii şi vârsta de 25 de ani, fără, însă, să dispară cu totul în os dar dispărând complet în cartilaj, unde lasă în totalitate locul produselor mature de hidroxipiridină.

     Kollerup et al. (1992) confirmă că piridinolina şi hidroxipiridinolina sunt formele sub care se prezintă legăturile intercatenare în colagenul matur. Kim et al. (1994) descriu piridinolina ca un “cross-link” matur al fibrei de colagen la cobai; după vârsta de 2 luni, concentraţia ei creşte marcat dar tinde să scadă după 10 săptămâni în cartilaj dar nu şi în tendon (la om, scăderea intervine după adolescenţă).

     Thomas et al. (1992) constată că la şobolanii de 23 de luni, concentraţia prolinei şi oxiprolinei în muşchii papilari este mai mare decât la vârsta de 5 luni iar concentraţia ventriculară de hidroxilizil-piridolină creşte de 5 ori la şobolanul bătrân în comparaţie cu cea de la şobolanul tânăr, ajungând la 0,285 mol/mol colagen. Această valoare indică gradul de maturare a colagenului prin formare de legături ireductibile. Autorii mai arată că antrenamentul fizic reduce acesată valoare la 0,131 mol/mol colagen.

     Se poate afirma cu certitudine că, în toate cazurile, densitatea legăturilor intercatenare la nivelul colagenului creşte cu vârsta. Koyama et al. (1993), plecând de la constatarea că hidroxiprolina din sânge provine din descompunerea colagenului din ţesuturi şi că nivelul ei scade odată cu înaintarea în vârstă, deduce că aceasta înseamnă că are loc o creştere a numărului de legături încrucişate. 

     Cu vârsta, colagenul din muşchi devine mai rigid, ca urmare a creşterii numărului de legături intercatenare. în lucrarea în care descrie acest fapt, Takahasi (1992) adaugă că procedeele de frăgezire a cărnii se bazează nu pe ruperea acestor legături ci, mai curând, pe ruperea miofibrilelor.

     Faptul că timpul de rupere a fibrelor din tendonul cozii de şobolan creşte cu vârsta este, de asemenea, un indiciu privind creşterea continuă a concentraţiei legăturilor intercatenare la nivelul colagenului (Heller & McClearn, 1992). Tot odată, aşa cum s-a menţionat ceva mai devreme, timpul de rupere (breaking time) creşte ca urmare a intensificării procesului de glicare (Monnier et al.,1988) iar acest fapt este un indiciu al legăturii care există între glicosilare şi interconectarea prin legături încrucişate.

     Este, de asemenea, evident faptul că modificarea proprietăţilor mecanice ale colagenului este un rezultat direct al creşterii numărului de legături intercatenare. Creşterea rezistenţei mecanice, creştere asemănătoare celei care se produce în procesul industrial de tanare (tăbăcire), nu este singurul rezultat al creşterii numărului de legături intercatenare. Au loc, de asemenea,  reduceri ale spaţiului dintre lanţurile moleculei de colagen ca şi dintre moleculele de colagen, blocarea reactivităţii chimice a unor grupări dispuse de-a lungul lanţului colagenic, scăderea gradului de hidratare al colagenului şi micşorarea turnoverului colagenului (Velican & Velican, 1970).

     Între glicosilare şi legare intercatenară există o legătură directă, deoarece produşii finali ai glicării avansate pot juca rolul unor agenţi de legare, aşa cum este cazul pentozidinei. Takahashi et al. (1994) afirmă că numărul legăturilor intercatenare mature (piridolină) nu  creşte cu vârsta (eventual chiar scade puţin), spre deosebire de numărul legăturilor intercatenare senescente (pentozidin) care creşte cu timpul. Akiba et al. (1993) demonstrează creşterea numărului de legături intercatenare ale colagenului în corpul vitros al ochilor vârstnicilor.

     După Sensi et al. (1991), PFGA pot altera structura terţiară a macromoleculelor de colagen şi, astfel, pot bloca funcţia acestora. Mai mult, încă, poate apărea un adevărat cerc vicios în care glicosilarea, prin legăturile intercatenare generate, micşorează turnoverul colagenului, făcându-l astfel mai vulnerabil la glicosilare etc.

 

     Modificări senescente ale fibrelor elastice. Fibrele elastice din matrixul extracelular şi din ţesutul conjunctiv sunt alcătuite dintr-un miez central de elastină, înconjurat de o teacă microfibrilară care conţine fibrilină, glicoproteine şi o proteină cu greutatea moleculară de 35 kDa, dotată cu activitate enzimatică amino-oxidazică.

     Elastina este un component major al fibrelor elastice, în special al celor aflate în matrixul extracelular. După Hernandez (1992), ea lipseşte din unele formaţii ca lamina cribrosa din ochiul omului aflat în stadiul fetal de dezvoltare, apare ca agregate la copii şi poate fi identificată în fibrele elastice la adulţi; aceste fibre devin mai groase pe măsura înaintării în vârstă şi capătă un aspect tubular, fiind înconjurate de fibre de colagen dens împachetate.

     Elastina este o proteină hidrofobă rezistentă la procesul de glicosilare. Ea conţine multă prolină şi glicină dar puţină hidroxiprolină şi hidroxilizină. Moleculele de elastină sunt conectate prin intermediul unor legături intercatenare ce se realizează la nivelul rezidurilor lizinei într-un mod asemănător celui întâlnit în cazul colagenului şi care realizează, astfel, reţele extinse (figura 24).

 

 

 

     Fig. 24 - Reprezentare schematică a reţelelor alcătuite de moleculele de elastină şi a modului în care se manifestă elasticitatea acestora în cursul solicitărilor mecanice

 

     Moleculele de elastină au tendinţa de a-şi păstra conformaţia 'random coil' (ghem statistic) determinată de agitaţia moleculară termică. Sub efectul solicitărilor mecanice, moleculele de elastină capătă forme mai mult sau mai puţin liniare, pentru ca la încetarea stress-ului mecanic să revină la forma de ghem, utilizând energia oferită de mişcările proprii de agitaţie termică precum şi impulsurile primite din partea altor molecule ce se agită termic în imediata lor vecinătate. Elasticitatea lor este remarcabilă, depăşind de 5 ori pe cea a cauciucului natural. Această elasticitate este, însă, limitată ca urmare a asocierii elastinei cu fibre inextensibile de colagen precum şi a apariţiei, odată cu înaintarea în vârstă, a unui număr tot mai mare de legături covalente între domenii aparţinând uneia şi aceleiaşi molecule de elastină. 

     Vitarello-Zuccarello et al. (1994) arată că, la om, densitatea fibrelor elastice din piele creşte în primul deceniu de viaţă, după care scade. La femei, volumul relativ ocupat de fibrele elastice scade după 20 de ani, în timp ce la bărbaţi scăderea se instalează după 40 de ani.

     După Powell et al. (1992), elastina nu mai este sintetizată după atingerea vârstei mature a organismului din care face parte. Această concluzie se bazează pe faptul că, începând de anii tinereţe şi până la vârste înaintate (peste 80 de ani), cantitatea de D-aspartat în elastină creşte liniar de la 3% la 13%. Devine explicabil faptul că raportul elastină/colagen scade cu vârsta, aşa cum constată Camilleri (1992), care determină valoarea acestui raport în  matrixul extracelular din pereţii vaselor sangvine.

     Ruckman et al. (1994) explică declinul cu vârsta al cantităţii de elastină prin hipermetilarea genei elastinei.

     Pe de altă parte, elastina este supusă atacului unor elastaze, care sunt responsabile de liza fibrelor elastice ce are loc în mod treptat pe măsură ce organismul se maturizează şi îmbătrâneşte. Robert et al. (1984) remarcă creşterea cu vârsta a concentraţiei serin-proteazei legată de membrana celulelor musculare netede din pereţii arterelor precum şi a metalo-proteazei din fibroblastele pielii, enzime ce atacă în special glicoproteinele din fibrele elatice dar şi elastina.

     Din cele de mai sus, rezultă că senescenţa matrixului extracelular are ca rezultat rigidizarea acestuia nu numai prin legăturile intercatenare care afectează moleculele de colagen ci şi datorită degradării elastinei. La acestea se adaugă scăderea cantităţii de proteoglicani şi degradarea cu timpul a acestora în condiţiile în care glicoproteinele structurale de tipul fibronectinei pot creşte cu vârsta în ţesuturi (Robert, 1986).

 

     Senescenţa celulelor nervoase

     Scăderea numărului de neuroni ca urmare a senescenţei. Celulele nervoase şi musculare sunt, prin excelenţă, celule fixe post-mitotice aflate în imposibilitatea de a se multiplica prin diviziune. Pe măsura înaintării în vârstă a organismului, celulele nervoase şi musculare îmbătrânesc iar unele dintre ele pier prin apoptoză  sau prin necroză celulară.

     Datele din literatură privind pierderile de neuroni ce survin odată cu înaintarea în vârstă sunt, aparent, contradictorii. Unii autori comunică mari pierderi de neuroni iar alţii nu sesizează vreo reducere a numărului de celule nervoase la organismele vârstnice sau constată, chiar, o creştere a densităţii numerice neuronale la vârste înaintate (Ramos et al., 1995). în realitate, amploarea pierderilor de neuroni diferă de la o regiune a creierului la alta şi de la o specie la alta.

     M.Rockstein (J.Cell.Comp.Physiol. 1950, 35, 11023, citat în Strehler, 1962) numără neuronii din secţiunile transversale ale creierelor unor albine având vârste cuprinse între o zi şi 70 de zile şi notează o scădere importantă a numărului de neuroni, de la 520 la 330, scăderea fiind liniară în raport cu timpul.

     H. Brody (J. Comp. Neurol. 1955, 102, 511, citat de Strehler, 1962) studiază secţiuni la nivelul unui număr de 4 regiuni ale cortexului cerebral uman şi constată o scădere a numărului de neuroni, mai ales în girul temporal superior. în ceea ce priveşte celulele nervoase mari de tip Purkinje din cerebel, R.S.Elis (J.Comp.Neurol. 1920, 32, 1, citat de Strehler, 1962) menţionează pierderea unui sfert din numărul iniţial de neuroni.

     Alţi autori nu găsesc pierderi importante de neuroni ca urmare a îmbătrânirii. Vincent et al. (1989) nu detectează asemenea pierderi în aria 17 a cortexului vizual al maimuţelor rhesus nici chiar la vârste înaintate ale acestora (25-35 de ani).

     Karhunen et al. (1994), referindu-se la neuronii Purkinje din vermisul cerebelar al omului, constată că nici numărul şi nici densitatea topografică a acestora nu scad cu vârsta. La şobolani, numărul neuronilor Purkinje şi cel al neuronilor granulari nu se modifică în timp dar stratul contactelor lor sinaptice se subţiază cu vârsta (Dlugos & Pentney, 1994). Monji et al. (1994) stabilesc că la şobolan numărul neuronilor adrenergici şi noradrenergici rămâne constant de-a lungul timpului.

     Sturrock (1992) numără neuronii din nucleul paraventricular din creierul unor şoareci în vârstă de 6, 25, 28 şi 31 de luni şi nu găseşte o variaţie semnificativă cu vârsta a numărului de celule nervoase.

     Acelaşi Sturrok constată în 1989 (Sturrok, 1989a) că numărul neuronilor mari ai nucleului vestibular lateral din creierul şoarecilor scade de la 488 (la 25 de luni) la 298 (la 31 de luni). în schimb, numărul neuronilor mici din aceeaşi regiune nu scade cu vârsta, aceştia acumulând, de altfel, cantităţi mult mai mici de lipofuscină decât neuronii mari. Studiind densitatea numerică neuronală în nucleul reticular talamic al şobolanilor, Ramos et al. (1995) constată o tendinţă de scădere a acesteia, începând cu luna a treia de viaţă şi până în luna a 24-a, urmată de o creştere semnificativă între lunile 24 - 30.

     Numărul de neuroni din nucleii intracerebrali ai şoarecilor rămâne constant între 6 şi 22  luni de viaţă, după care scade semnificativ, de la 6970 la 4140 (Sturrock, 1989b). Numărul de neuroni scade şi în nucleul cuneat extern al şoarecelui, începând din cea de a 15-a săptămână de viaţă, scăderea accentuându-se cu vârsta (Sturrock, 1989c).

     Modificări senescente ale neuronilor. în ceea ce priveşte neuronii cerebrali, au fost consemnate neregularităţi tot mai numeroase odată cu înaintarea în vârstă, legate de dimensiunea şi de forma celulei şi a nucleului acestora; apar invaginări ale membranei nucleului (Andrew, 1969) care sugerează un proces de diviziune amitotică.

     Acumularea de granule de lipofuscină este întâlnită în mod constant şi nu diferă substanţial, în aspectele pe care le ia, de fenomene similare care au loc în alte celule. Se semnalează, însă, apariţia în corpul neuronal şi în prelungirile sale a unor incluziuni citoplasmatice, având dimensiuni cuprinse între 5 şi 50 micrometri şi fiind alcătuite în exclusivitate din granule de alfa-glicogen sau beta-glicogen (Gertz et al., 1985). Autorii subliniază faptul că cele două tipuri de glicogen nu coexistă niciodată în aceeaşi celulă. Aceste granule au fost observate în neuronii din creierul unor oameni în vârstă de peste 60 de ani şi reflectă, probabil, tulburări în metabolismul hidrocarbonatelor. Nu s-au observat granule de glicogen legate de membrane.

     În neuronii senescenţi pot fi întâlnite mitocondrii degenerate. Numărul neurofilamentelor şi al neurotubulilor creşte în axoni, acest fenomen putând fi cauza dar şi efectul micşorării vitezei cu care se efectuează transportul axoplasmic.

     Frolkis et al. (1984, 1985) urmăresc migrarea prin axoni a unor substanţe marcate radioactiv (inclusiv proteine) şi constată o micşorare a vitezei lor de deplasare în axonii şobolanilor bătrâni. Viteza de transport este mai mică în zonele distale ale axonilor faţă de cea din zonele mai apropiate de corpul neuronal. Oprirea completă a fluxului axonal cu ajutorul colchicinei are efecte mai mici asupra pragului de excitabilitate şi asupra potenţialului de membrană în cazul în care axonul aparţine unui animal bătrân. Hipoxia, ca şi inhibiţia glicolizei cu ajutorul fluorurii de sodiu produc o decelerare mai intensă a fluxului axonal la şobolanii bătrâni iar  dipropionatul de estradiol accelerează transportul axonal mai cu seamă la şobolanii bătrâni  (spre deosebire de propionatul de testosteron care are efecte acceleratoare mai mari la şobolanul adult).

     Modificările survenite în regimul de transport axonal la vârstnici pot fi cauza pentru care regenerarea axonului după secţionare necesită mai mult timp la nervii organismelor bătrâne decât la cei aparţinând tinerilor (Vaughan, 1992). Axonii regeneraţi provenind din neuronii senescenţi au o concentraţie neobişnuit de mare de microtubuli iar raportul neurofilamente/ neurotubuli este foarte scăzut, sugerând o implicare puternică a citoscheletului în procesele de senescenţă.

     În mod similar, regenerarea fibrelor musculare după degenerarea lor prin injectare de buvicaină necesită trei săptămâni la şobolanii bătrâni, adică triplu decât la cei tineri (Sadeh, 1988).

     Frolkis et al. (1984) studiază neuronii unei moluşte (Lymnaea stagnalis) foarte înaintată în vârstă şi remarcă distrugerea cristelor mitocondriale, apariţia de autofagozomi şi corpuri reziduale dar şi punerea în valoare a unor mecanisme adaptative constând în hipertrofia mitocondriilor, hiperplazia aparatului Golgi şi creşterea ariei membranei nucleare. Autorii  nu observă, însă, modificări ale potenţialului electric de repaus, ale amplitudinii potenţialului de acţiune sau ale rezistenţei electrice a membranei celulare deşi unii parametri ai excitabilităţii se modifică cu vârsta iar sensibilitatea neuronilor bătrâni la acetilcolină, noradrenalină şi serotonină creşte.

     Literatura de specialitate nu consemnează, însă, o unanimitate de păreri cu privire la semnele  senescenţei la neuroni. Mulţi autori neagă aceste modificări deteriorative ce ar surveni odată cu înaintarea în vârstă a neuronilor. Vincent et al. (1989) ajung la concluzia că neuronii din aria 17 a cortexului cerebral aparţinând unor exemplare bătrâne de maimuţe rhesus nu prezintă modificări structurale semnificative; mai afectate de vârstă par a fi prelungirile dendritice şi axonale. Cruz-Sanchez et al. (1995) studiază neuronii din substantia nigra a omului şi constată că la vârstnici, profilul corpului neuronal devine distorsionat iar dendritele apar umflate din loc în loc, semănând cu un şirag de mătănii. La cei foarte vârstnici, pierderea de dendrite devine evidentă. Autorii nu consemnează, însă, modificări citoscheletale de tipul celor din maladia Parkinson.

     Imaginile microscop-electronice ale terminaţiilor axonale sinaptice nu arată vreo scădere a numărului mediu de vezicule sinaptice ci, mai curând, o tendinţă de aglutinare a acestora către zona plăcii terminale (Gutmann et al., 1971).

     Studiind ultrastructura nucleului caudat din creierul pisicii, Levine et al. (1988) constată că, după 3 ani de viaţă, densitatea sinapselor scade, concomitent cu apariţia unor sinapse neobişnuit de lungi; neuronii încep să acumuleze lipofuscină, cu deosebire dendritele şi corpul neuronal. Saits et al. (1994) arată că la şobolanii vârstnici scade numărul sinapselor în creier iar conţinutul de sinaptofizin se reduce la 77-60% din cel existent la animalele tinere.

     Smith (1988) menţionează trei trăsături caracteristice ale senescenţei sistemului nervos : (1) deficit al transmisiei sinaptice, (2) reglare defectuoasă a nivelului de calciu în neuron şi (3) modificări ale arborizaţiei neuronale. El constată că în sinaptozomii izolaţi de la animale bătrâne, fluxul transmembranar de calciu este mai mic decât la animalele tinere. Gradul de arborizare al dendritelor şi axonilor creşte, până la un moment dat, cu vârsta; la vârste înaintate, însă, gradul de arborizare scade.

     Se apreciază că la vârste înaintate are loc o scădere a plasticităţii neuronale atât în sistemul nervos central cât şi în cel periferic. Plasticitatea neuronilor cerebrali este un proces compensator prin care sistemul nervos central se adaptează la boli, droguri sau la pierderi de neuroni. Unul dintre aspectele plasticităţii neuronale se referă la modificarea numărului de receptori membranari, a expresiei ARN-ului mesager pentru proteinele care intră în alcătuirea receptorilor precum şi a cuplajului  dintre receptori şi sistemul de traducere al semnalelor la nivelul membranei. Pedigo (1994) constată scăderea cu vârsta a plasticităţii neuronale în general şi a celei ce se referă la receptorii muscarinici, în special.

     Mori (1993) încearcă să identifice cauzele acestui proces, urmărind profilul proteinelor neuronale asociate creşterii ca şi mecanismul de reglare a inducţiei lor de către factorul de creştere neuronală. El studiază în mod deosebit proteina SCG 10 care menţine un grad înalt de plasticitate în cursul sinaptogenezei şi consideră că mai sunt necesare astfel de studii atât în cazul unor afecţiuni patologice ale creierului cât şi în procesele de îmbătrânire.

     Odată cu înaintarea în vârstă, raportul dintre substanţa cenuşie şi cea albă din creier scade până la 50 de ani, după care creşte, aşa cum arată Harris et al. (1994) care au folosit tehnica rezonanţei magnetice nucleare.

     În creierul vârstnicilor se întâlnesc diverse alte modificări senescente. Pokras (1994) constată o similitudine între îmbătrânirea creierului şi efectele intoxicaţiei cu glutamat. Yang & Wang (1994), confirmând datele ce se referă la şobolani, constată că în hipocampul uman, vârsta înaintată se însoţeşte de apariţia în neuroni a unei cantităţi importante de terminin (polipeptid de 63 kDa despre care s-a mai vorbit în capitolul despre senescenţa clonală).

     În neuronii cerebrali se acumulează proteine oxidate, apar dezordini ale citoscheletului iar activitatea creatin-kinazei şi a glutamat-sintetazei scade (Carney et al., 1994).

     O problemă specifică pentru sistemul nervos central este apariţia cu vârsta a plăcilor de amiloid (plăci senile sau plăci neuritice) şi a împâslirilor neurofibrilare intraneuronale (“neurofibrillar tangle”). După Dani et al. (1994), în senescenţă apar mai întâi plăcile senile şi apoi împâslirile neurofibrilare. Boures et al. (1994) îi contrazic, însă, afirmând că au întâlnit în creierul uman împâsliri neurofibrilare fără plăci senile dar niciodată plăci amiloide fără împâsliri neurofibrilare. Tot ei observă că depunerile de amiloid apar mai devreme în neocortex decât în hipocamp. Nakamura et al. (1994) depistează la şobolanii bătrâni acumularea precursorului de amiloid în dendritele şi în corpul neuronilor Purkinje.

 

     Senescenţa fibrelor musculare

     Modificări ale numărului de fibre în muşchii senescenţi. în ceea ce priveşte pierderile înregistrate în rândul fibrelor musculare, numeroşi autori scot în evidenţă faptul că există o disparitate între reducerea numărului de fibre musculare în procesul de atrofie senilă a muşchilor şi reducerea concomitentă a numărului fibrelor nervoase motorii care inervează muşchii respectivi.

     J. E. Birren şi P. D. Wall (J. Comp. Neurol. 1956, 104, 1, citat de Strehler, 1962) afirmă că numărul de fibre motorii nervoase din nervul sciatic de şobolan nu scade cu vârsta.

     Într-adevăr, se pare că pierderile de fibre musculare în senescenţă sunt mai mari decât pierderile înregistrate în rândul  neuronilor motori care inervează aceste fibre (Gutmann & Hanzlikova, 1966; Gutmann et al., 1968).

     Probabilitatea dispariţiei prin apoptoză a fibrelor musculare creşte cu vârsta, astfel încât aria secţiunii transversale a muşchiului scade fără, însă, ca numărul unităţilor motorii să fie afectat (unitatea motorie este un ansamblu alcătuit dintr-un neuron motor şi din totalitatea fibrelor musculare pe care le inervează).

     Lexell et al. (1988) analizează secţiuni transversale în muşchii vastus lateralis care au aparţinut unui număr de 43 de oameni având vârste cuprinse între 15 şi 83 de ani. Ei constată că atrofia acestui muşchi debutează în jurul vârstei de 25 de ani, după care continuă până la moarte. Atrofia se datorează în special micşorării numărului de fibre musculare şi mai puţin micşorării diametrului acestora. Nu există o preferinţă în acest sens pentru fibrele rapide sau pentru cele lente.

     Se ştie că în muşchi există mai multe tipuri de fibre. Stein & Padykula (1962) clasifică fibrele musculare în fibre de tip A, B şi C, în funcţie de nivelul activităţii enzimatice oxidative şi glicolitice. Engel (1962) clasifică altfel fibrele musculare, în funcţie de nivelul activităţii ATP-azice; el denumeşte fibrele cu activitate scăzută fibre lente sau de tip I iar pe celelalte, fibre rapide sau de tip II. Studiind muşchiul soleus al şobolanilor având vârste de 3, 12 şi 24 de luni, Fujimoto et al. (1994) observă că numărul total de fibre rămâne nemodificat; ei nu constată transformări ale fibrelor de tip I în fibre de tip II sau invers.

     Ishihara et al. (1987) compară pierderile de fibre musculare din muşchiul soleus cu pierderile de fibre nervoase din nervul tibialis anterior care inervează acest muşchi. Numărul fibrelor musculare rapide scade la şobolani începând cu vârsta de 65 de săptămâni, spre deosebire de fibrele lente şi de neuroni care încep să scadă numeric abia după vârsta de 135 de săptămâni de viaţă.

     Din datele menţionate mai sus rezultă că dispariţia fibrelor musculare nu este o consecinţă a unei denervări a lor  deoarece fibrele nervoase care le inervează nu dispar. Aceasta nu înseamnă, desigur, că neuronii, chiar dacă nu mor, nu pot fi  capabili să influenţeze într-un fel sau altul destinul celulei musculare cu care stabilesc contacte sinaptice, şi aceasta deoarece, după cum s-a menţionat mai sus, neuronii  sunt marcaţi progresiv de senescenţă.

     Fibrele musculare şi neuronii care supravieţuiesc suferă modificări mai mult sau mai puţin vizibile la nivel microscopic şi ultramicroscopic.

     Modificări ale fibrelor musculare, asociate senescenţei. Modificările structurale şi ultrastructurale care survin la celulele musculare senescente sunt asemănătoare celor ce apar după denervarea muşchilor (Gutmann & Hanzlikova, 1972/1973). Elementele reticulului sarcoplasmic şi tubulii transversali proliferează, ceea ce duce la apariţia, pe alocuri, a pentadelor în locul triadelor (triada este denumirea dată ansamblului format dintr-o porţiune a unui tubul transvers şi cele două cisterne ale reticulului sarcoplasmic cu care este în contact strâns; la nivelul triadei se eliberează ionii de calciu din cisterne ca urmare a excitaţiei fibrei musculare). Creşte cu vârsta numărul de nuclei din fibrele musculare striate, iar nucleii au tendinţa să ocupe poziţii mai centrale. Creşte şi cantitatea de ADN din fibră, probabil ca urmare a unor diviziuni amitotice ale nucleilor, aşa cum sugerează apariţia unor invaginări ale membranei nucleare.

     Membrana bazală a fibrelor musculare se îngroaşă şi se rigidizează (ceea ce dă bătăi de cap gospodinelor când prepară carnea unor animale bătrâne) iar spaţiile sinaptice devin mai largi.

     Cu vârsta, se remarcă tot mai numeroase granule de glicogen în vecinătatea sarcolemei, pentru a nu mai vorbi despre nelipsitele acumulări de granule de lipofuscină. Liniile Z care delimitează sarcomerele devin mai mari şi au forme mai neregulate.

     Schmucker & Sachs (1985) studiază cu ajutorul microscopului electronic miocardul ventricular al unor şobolani Fischer 344, în vârstă de 6, 16 sau 30 de luni. Ei constată că fracţiunea din volumul celulei ocupată de mitocondrii, ca şi masa miofibrilelor şi a lipidelor, rămân neschimbate de-a lungul timpului. în schimb, volumul ocupat de corpii denşi creşte de 4 ori între 6 şi 30 de luni iar elementele reticulului sarcoplasmic manifestă o creştere numai între 6 şi 16 luni, după care rămân neschimbate. Autorii analizează şi activitatea enzimatică a două enzime lizozomale, constatând că fosfataza acidă are o activitate constantă iar activitatea ß-glucuronidazei manifestă o uşoară tendinţă de creştere.

     Variaţii mai mari cu vârsta au fost observate în ceea ce priveşte unele molecule implicate în reacţiile redox (glutation, NAD şi NADP) (Noy et al., 1985). La şobolanii bătrâni, concentraţia formei oxidate a glutationului creşte mult în defavoarea concentraţiei formei reduse.

      în general, aşa cum arată Klausner & Schwartz (1985), nu se pot aduce dovezi convingătoare conform cărora declinul funcţional al muşchiului poate fi atribuit doar modificărilor asociate senescenţei propriu zise. Inevitabil, participă în acest proces leziunile produse de-a lungul timpului în contextul unor boli asociate vârstelor mai înaintate. Dacă modificările patologice sunt mai numeroase în celulele musculare din miocardul, din valvele şi din arterele coronare ale vârstnicilor, aceasta se datorează şi faptului că  structurile vii menţionate au avut mai mult de suferit de pe urma unor boli decât structurile similare aparţinând tinerilor. Pot fi puse exclusiv pe seama senescenţei numai acumularea de lipofuscină şi amiloid precum şi degenerarea bazofilă a muşchiului cardiac.

     În ceea ce priveşte anumite regiuni ale inimii ce conţin tipuri speciale de celulele musculare, s-a constatat că nodurile atrio-sinusal şi atrio-ventricular se micşorează cu vârsta şi sunt progresiv infiltrate cu fibre de colagen, elastină şi reticulină precum şi cu grăsimi. Leziuni similare dar mai puţin marcate pot fi întâlnite şi la nivelul fasciculului lui Hiss şi al fibrelor lui Purkinje (Gutman & Hanzlikova, 1973).

     Beregi et al. (1988) examinează microscop-electronic fibre musculare scheletale provenite de la oameni tineri şi de la oameni bătrâni, precum şi de la şoareci tineri şi şoareci bătrâni. Ei constată că senescenţa produce modificări importante la nivelul mitocondriilor, ale căror criste nu mai sunt atât de regulat dispuse spaţial şi prezintă îmtreruperi, fiind, în parte sau în totalitate, înlocuite cu structuri lamelare asemănătoare mielinei. Se observă, adesea, mitocondrii gigante. Evident, lipofuscina este prezentă, mai cu seamă în vecinătatea mitocondriilor din fibrele musculare ale vârstnicilor.

 

     Rolul agravant al ischemiei în senescenţa tesuturilor nervoase şi musculare. Leziunile observate în celulele nervoase şi musculare pot avea drept cauză modificările senescente propriu zise, cu punct de plecare intracelular; ele pot rezulta şi din reducerea fluxului sangvin şi, deci, din consecinţele acestei reduceri în privinţa nutriţiei şi oxigenării celulelor. Baron & Marchal (1992) utilizează tomografia prin emisie de pozitroni (PET), capabilă să măsoare simultan fluxul sangvin şi parametrii metabolici (consumul de oxigen şi de glucoză) în una şi aceeaşi regiune din creier. în senescenţa normală are loc o scădere progresivă a consumului de oxigen şi de glucoză, concomitent cu reducerea fluxului sangvin, cu deosebire în neocortexul cerebral. Intensitatea acestor fenomene creşte în cazul existenţei unor leziuni vasculare multiple. In 1992, Marchal et al. (1992) utilizează aceeaşi tehnică (PET) şi constată o scădere liniară a consumului de oxigen cu vârsta (de circa 6% pe deceniu); talamusul şi cerebelul nu par a fi la fel de intens afectate de acest tip de senescenţă.

     Deoarece bariera hemato-encefalică este un modulator major al distribuţiei oxigenului şi substanţelor nutritive în sistemul nervos central, modificările senescente ale acestei bariere devin importante prin posibilele lor urmări  asupra stării neuronilor. Mooradian (1988) menţionează, printre modificările ce apar odată cu înaintarea în vârstă, pierderi de celule din endoteliul capilar, compensate prin alungirea endoteliului rămas, ceea ce duce la îngustarea capilarelor în cortexul cerebral al şobolanilor bătrâni (dar nu şi în cel al maimuţelor şi al oamenilor) precum şi o scădere cu vârsta a numărului de mitocondrii în celulele endoteliale ale capilarelor maimuţelor (dar nu şi în cele ale şobolanului). Scade transportul colinei şi al glucozei prin bariera hemato-encefalică; transportul amino-acizilor nu pare, însă, a fi alterat odată cu înaintarea în vârstă. în sindromul Alzheimer modificările menţionate sunt mai accentuate. în aceste modificări pot fi antrenate şi celulele musculare netede din pereţii arteriolelor care se pot modifica până într-atât încât să fie considerate 'străine' de către macrofage şi eliminate. Proteinele cu viaţă lungă din substanţa fundamentală a ţesutului conjunctiv pot fi glicosilate (prin reacţia Amadori) şi se pot acumula, îngroşând intima. Toate acestea duc, în final, la diminuarea fluxului de nutrienţi şi la îngreunarea pasajului transendotelial al macrofagelor (Lagerlof & Nilsson, 1989).

 

     Declinul funcţional al sistemului neuro-muscular. Modificările cele mai evidente care intervin în sistemul neuromuscular pe măsura trecerii timpului fac parte din următoarele trei categorii: (1) micşorarea vitezei de propagare a impulsului nervos de-a lungul axonilor, (2) micşorarea randamentului transmisiei sinaptice şi (3) micşorarea forţei şi vitezei de contracţie a fibrelor musculare.

     Ganeriwal et al. (1983) măsoară viteza de conducere a impulsului nervos în nervii ulnar şi median aparţinând unui număr de 75 de persoane sănătoase. Ei confirmă scăderea cu vârsta a vitezei de conducere, scădere mai accentuată în segmentele distale ale nervilor investigaţi. Hasegawa et al. (1993) arată că viteza conducerii impulsului nervos prin nervul median de om scade cu vârsta; la fel se petrece şi cu amplitudinea potenţialului de acţiune al aceluiaşi nerv.

     Wilson & Cardaman (1984) studiază modificările fiziologice, ce intervin odată cu înaintarea în vârstă, în procesul transmisiei neuromusculare la şobolani având vârste cuprinse între 28 şi 364 de zile. Ei folosesc un sistem de înregistrare a potenţialelor plăcii terminale în muşchiul diafragmatic, în condiţiile în care potenţialul electric generat de fibra musculară a fost eliminat prin tăierea fibrei. Sobolanii în vârstă de 28 de zile stochează mai puţine vezicule sinaptice şi eliberează mai puţine cuante de mediator cu ocazia excitării decât şobolanii în vârstă de 42 de zile. După această vârstă, parametrii presinaptici ai transmisiei neuro-musculare nu se mai modifică până la vârsta de 364 de zile, fapt care permite autorilor să conchidă că şobolanii ating maturitatea, din acest punct de vedere, la vârsta de 6 săptămâni.

     Două mecanisme neuronale de bază pot fi afectate odată cu înaintarea în vârstă: (a) funcţia pe termen scurt a sinapsei, implicând participarea membranei în recepţia şi în conducerea impulsului nervos şi (b) funcţia trofică pe termen lung a sinapsei, legată de sinteza, transportul şi eliberarea spontană a unor macromolecule, polipeptide şi mediatori chimici care stimulează fibra musculară inervată.

     Aşa cum s-a mai arătat, funcţia pe termen scurt a sinapsei nu pare a fi afectată de trecerea timpului; nu acelaşi lucru se poate spune, însă, despre funcţia trofică a transmisiei sinaptice, deoarece există dovezi privind scăderea ritmului de sinteză a proteinelor neuronale, asociată cu încetinirea transportului acestora de-a lungul axonilor. Gutmann & Hanzlikova (1973) cred că aceste fenomene pot explica diminuarea acţiunii trofice nervoase asupra celulelor musculare, chiar în condiţiile în care numărul axonilor inervanţi nu se modifică cu vârsta.

     Autorii citaţi insistă asupra similitudinilor dintre atrofia senilă a muşchiului şi atrofia în urma denervării muşchiului. Aceste asemănări cuprind şi aspecte numite de ei 'dediferenţierea ' fibrelor musculare, în sensul că diferenţierea acestor fibre în fibre lente şi rapide tinde să dispară, atât în denervare cât şi în senescenţă.

     în cazul atrofiei musculare senile se poate vorbi de o denervare funcţională, lipsită de modificări ultrastructurale ale sinapsei neuro-musculare dar însoţită de reducerea eliberării spontane de mediatori şi de scăderea sintezei la nivel presinaptic.

     Destinul comun al fibrelor musculare şi al fibrelor nervoase care le inervează nu este surprinzător, dacă se ia în considerare faptul că în perioada embrionară fibrele nervoase îşi adjudecă fibrele musculare în vederea inervării după o adevărată competiţie soldată cu victime (moartea unor fibre nervoase prin apoptoză). Se pare că răsplata pentru inervare este un efect trofic retrograd al fibrei musculare ţintă, efect care creşte vitalitatea neuronului angajat în joncţiunea neuro-musculară (Lichtman, 1987).

     În ceea ce priveşte performanţa mecanică a muşchiului, se constată, ca o confirmare a teoriei dediferenţierii fibrelor, că viteza de contracţie a fibrelor rapide scade cu vârsta iar cea a celor lente creşte. Aceste modificări sunt însoţite de schimbările corespunzătoare ale activităţii ATP-azice actomiozinice (care creşte în fibrele lente şi scade în cele rapide).

     În ceea ce priveşte forţa de contracţie, Phillips et al. (1991), studiind muşchii soleus ai şoarecilor tineri (2,5 - 8 luni) şi vârstnici (28 -31 luni) constată că atât forţa maximă în condiţii izometrice cât şi forţa în contracţiii izotonice (bineînţeles, raportate la aria secţiunii transversale a muşchilor) scad la şoarecii vârstnici cu 13,3 %. Timpul de relaxare, reprezentând scăderea forţei generate într-un tetanus (de la 90 % la 10 %), este mai lung la şoarecii bătrâni. Autorii subliniază faptul că, în aceste condiţii, raportul dintre forţa izometrică şi cea izotonică nu depinde de vârstă. 

     Nici forţa generată prin alungirea bruscă a unui muşchi contractat nu variază cu vârsta. Aceste modificări seamănă bine cu cele care survin în condiţiile în care creşte concentraţia de fosfat anorganic (Pi) sau când pH-ul intracelular este scăzut, fapt care încurajează pe autori să facă unele speculaţii interesante legate de cauzele şi de mecanismele senescenţei fibrelor musculare.

     Alway (1995), studiind senescenţa muşchiului latissimus dorsi, constată că are loc o încetinire a secuselor (o creştere a duratei lor) precum şi o tendinţă mai mare de fuzionare a secuselor. Viteza de scurtare a muşchiului se micşorează dar forţa tetanică maximă rămâne constantă.

     Brooks & Faulkner (1994) arată că, deşi forţa de contracţie a muşchilor de şoarece scade atât în contracţia cu scurtare cât şi în cea izometrică, forţa de contracţie a fiecărei fibre în parte nu scade, ceea ce arată că mecanismul molecular al contracţiei musculare nu este afectat de senescenţă.

      În pofida tuturor celor scrise până aici cu privire la senescenţa celulelor nervoase şi musculare, rămâne cu adevărat impresionantă performanţa majorităţii acestor celule de a supravieţui presiunii timpului de-a lungul unor intervale de timp ce pot atinge şi depăşi un secol.

 

      Senescenţa eritrocitelor

     Aspecte particulare legate de senescenţa hematiilor.  Literatura de specialitate dedicată senescenţei eritrocitelor este relativ bogată, cel puţin în comparaţie cu cea consacrată îmbătrânirii altor tipuri de celule. Această situaţie se explică, probabil, prin facilităţile pe care le oferă investigarea acestor structuri celulare care se remarcă prin simplitate şi prin omogenitate morfologică şi funcţională şi care, în plus, sunt uşor de recoltat şi de manipulat în conformitate cu protocoalele tehnicilor experimentale curente.

     Cunoaşterea fenomenelor care au loc în eritrocitele senescente este, desigur, importantă în sine, permiţând o mai bună înţelegere a destinului biologic al acestui tip de celule şi furnizând informaţii valoroase atât cercetătorilor care studiază patologia hematologică cât şi celor care se ocupă cu probleme legate de transfuzia sângelui.

     Înţelegerea mecanismelor care determină îmbătrânirea hematiilor poate fi utilă, însă, şi pentru elucidarea unui mare număr de aspecte legate de senescenţa altor tipuri de celule precum şi pentru progresul cercetărilor care au ca scop identificarea unui mecanism general al senescenţei celulare.

     Globulele roşii, lipsite de nucleu la majoritatea speciilor, constituie un model experimental excepţional pentru verificarea numeroaselor ipoteze şi teorii care încearcă să identifice un proces sau altul drept cauze primare ale senescenţei.

     Evident, rezultatele observaţiilor efectuate pe hematii nu se aplică integral altor celule. Faptul că eritrocitele conţin proteine care nu se găsesc în alte celule, aşa cum este hemoglobina, nu exclude, însă, posibilitatea de a extrapola observaţiile cu privire la această macromoleculă la alte proteine, de exemplu, la acelea care funcţionează ca enzime respiratorii în majoritatea celulelor şi intervin în reacţiile chimice oxidante într-o manieră asemănătoare celei a hemoglobinei.

     Membrana globulului roşu nu este cu nimic mai prejos decât membrana altor celule, având, însă, avantajul de a fi mult mai bine cunoscută din punct de vedere structural şi funcţional; la fel stau lucrurile şi în cazul citoscheletului hematiei.

     Suprafaţa externă a membranei eritrocitare este angajată, ca şi suprafeţele altor celule, în procese de natură imunologică, având proprietăţi antigenice şi putând fi punctul de plecare al sintezei unor autoanticorpi. Studiul suprafeţei celulare a hematiilor se face în condiţii mult mai favorabile decât acelaşi studiu aplicat altor celule şi permite obţinerea unor rezultate mai precise şi mai credibile.

     Inexistenţa acizilor nucleici şi a mitocondriilor, ca şi scăzuta capacitate de autoapărare în faţa atacurilor radicalilor liberi, permit eludarea unor aspecte care nu pot fi trecute cu vedera în studiul senescenţei altor celule; este clar că senescenţa hematiei nu este controlată pas cu pas de ADN-ul cromozomal sau mitocondrial şi nici nu poate fi efectul unui dezechilibru lent între lezarea fizico-chimică a componenţilor celulari şi autorepararea acestora.

     Materialul din care este alcătuit eritrocitul se învecheşte, pur şi simplu, în timp, oferind celulei un timp mediu de viaţă de 120 de zile la om, 60 de zile la şobolan, 25 de zile la şoarece etc. Este evident că durata medie şi maximă de viaţă a eritrocitului, atât de dependente de specie, sunt programate genetic dar tot atât de clar este că informaţia genetică se mulţumeşte să stabilească fiabilitatea materialelor din care sunt confecţionate hematiile, deoarece comenzile de origine genetică nu mai pot interveni în decursul existenţei eritrocitului. Diferenţele în ceea ce priveşte durata vieţii  hematiilor între indivizii  aceleiaşi specii confirmă această deducţie şi demonstrează importanţa unor factori extracelulari în stabilirea în cele din urmă a longevităţii eritrocitului.

     Definirea termenului de 'senescenţă a eritrocitului'. Noţiunea de 'senescenţă a hematiilor' se poate aplica acestor celule în măsura în care se poate demonstra că mortalitatea hematiilor respectă relaţia lui Gompertz (vezi capitolul 4). Trebuie, deci, adusă dovada că globulele roşii mor sau sunt omorâte într-un ritm ce este dependent de vârsta lor. Intr-adevăr, la multe specii, inclusiv la om, hematiile dispar din circulaţie în această manieră, adică rata mortalităţii lor creşte pe măsură ce creşte şi vârsta atinsă de ele (figura 25).

     Există, însă, specii la care dispariţia din circulaţie a hematiilor  se dovedeşte a urma o cinetică de ordinul 1 (adică moartea hematiilor este un fenomen aleatoriu, figura 25 B) precum şi specii la care se constată o combinaţie între cele două forme (figura 25  C).

     O altă întrebare, al cărei răspuns este necesar pentru a aprecia dacă termenul de senescenţă se aplică în mod corect eritrocitelor, este legată de felul în care dispar hematiile (adică dacă mor de 'moarte bună' sau sunt omorâte). Din păcate, deşi se ştie că locul dispariţiei hematiilor bătrâne este sistemul reticuloendotelial din splină, ficat, oase etc., nu se poate afirma cu certitudine dacă ele sunt fagocitate de vii. Faptul că în anumite boli, cum sunt sferocitoza sau hidrocitoza, splenectomia prelungeşte viaţa hematiilor, pledează pentru ipoteza că acestea, în mod normal, sunt  omorâte.

     Studiul experimental al senescenţei eritrocitare.  Obţinerea unor cohorte de hematii bătrâne sau de hematii tinere se face, în mai toate cazurile, prin centrifugarea sângelui. Se consideră că hematiile senescente au o densitate mai mare decât cele tinere şi că, de aceea, se vor găsi după centrifugare la fundul eprubetei. La această concluzie au ajuns Borun et al. (1957) care au constatat că la scurt timp după reinjectarea unor hematii marcate  cu 59Fe, radioactivitatea coloanei de hematii este mai mare în partea ei superioară şi că, pe măsură ce trece timpul, noile analize prin centrifugare a sângelui arată că hematiile de la fundul eprubetei devin mai radioactive.

     Această situaţie este similară cu cea observată în cazul trombocitelor. Savage et al. (1986) marchează trombocitele babuinului cu 111In, le reinjectează şi analizează în gradient de densitate trombocitele  extrase după 6 zile de la acelaşi animal constatând că trombocitele cu densitate mai mare au şi un grad sporit de radioactivitate.

     Din păcate, după entuziasmul iniţial legat de descoperirea unei metode atât de simple pentru separarea hematiilor tinere de cele bătrâne, un număr tot mai mare de autori pun la îndoială corectitudinea acestei ipoteze. Cu toate acestea, şi în prezent hematiile senescente se prepară pe baza principiului conform căruia hematiile dense sunt, neîndoielnic, hematii bătrâne.

     Vincenzi & Hinds (1988), de exemplu, obişnuiesc să centrifugheze sângele timp de 30 de minute în tuburi subţiri de sticlă, după care recoltează 8 % din partea de sus a coloanei de hematii, considerând aceste eritrocite drept tinere; un alt procent de 8 % din coloana de hematii, recoltată începând de la stratul inferior este alcătuit, spun autorii, din hematii senescente. în alte lucrări se recurge la separarea hematiilor în gradient de densitate.

     Pentru obţinerea unei populaţii omogene de hematii senescente s-a apelat şi la alte metode, bazate pe ipotezele conform cărora hematiile bătrâne au dimensiuni mai mici decât cele tinere sau că hematiile bătrâne  manifestă un grad superior de fragilitate osmotică. Există şi convingerea că hematiile bătrâne au o densitate mai mică de sarcini negative la suprafaţă, fapt care ar permite separarea lor cu ajutorul electroforezei (Bartosz et al., 1984).

     Şi corectitudinea acestor metode este pusă la îndoială de un număr tot mai mare de autori. în plus, prezenţa printre hematii în proporţii variate şi insuficient precizate a reticulocitelor, care sunt foarte deosebite din multe puncte de vedere de eritrocitele mature, ridică numeroase probleme de interpretare a rezultatelor experimentale.

 

   Fig. 25- Curba supravieţuirii în timp a hematiilor de om (A), şoarece (B) şi porc (C). Pe ordonată este trecut procentul (sau fracţiunea) supravieţuitorilor iar pe abscisă este trecută vârsta în zile a hematiilor

 

                                   Fig. 26 - Reprezentare schematică a metodei de obţinere a hematiilor senescente prin transfuzii repetate

 

     Există, însă, o metodă de concentrare a hematiilor senescente in vivo, care cu greu poate fi atacată din punct de vedere logic. Este vorba de metoda hipertransfuziilor sau a transfuziilor repetate (figura 26).

     Prin această metodă se blochează eritropoieza la şobolanii ce alcătuiesc un anumit lot şi se recoltează sânge de la jumătate din animalele acestui lot pentru a fi injectat la cealaltă jumătate. Apoi, sângele recoltat de la jumătate din animalele noului lot rezultat este injectat la cealaltă jumătate etc. până ce se ajunge la un singur şobolan în sângele căruia vor exista numai hematii senescente a căror vârstă va putea fi uşor cunoscută (Ganzoni et al. 1971). Dacă se acceptă că aceste hematii sunt, într-adevăr, senescente, atunci faptul că densitatea lor nu este în toate cazurile mai mare decât cea socotită normală (Morrison et al., 1983) este încă un argument al celor care contestă semnul egalităţii pus între hematiile bătrâne şi hematiile cu densitate crescută.

     Toate cele de mai sus se referă la studiul senescenţei eritrocitelor in vivo. Este posibil, însă ca hematiile să îmbătrânească in vitro, în timp ce sunt stocate în vederea transfuziei sângelui. Există dovezi că hematiile îmbătrânesc în sângele conservat într-un mod asemănător celui ce are loc in vivo. De exemplu, Greenwalt & Dumaswala (1988) constată că microvezicularea hematiilor are loc atât in vivo cât şi in vitro; sunt, însă, necesare mai multe probe care să precizeze până la ce limite senescenţa hematiilor in vitro poate fi considerată identică cu cea in vivo.

     Modificări senescente ale eritrocitelor. în cele ce urmează vor fi prezentate principalele deosebiri constatate experimental între hematiile dense şi cele mai puţin dense, evitând intenţionat formulări care să se refere la deosebirile dintre hematiile bătrâne şi cele tinere.

     a) Reducerea concentraţiei intracelulare a ionilor de potasiu (Astrup, 1974; Cohen et al., 1976), explicabilă prin creşterea permeabilităţii membranei eritrocitare pentru  acest cation; un număr mai mic de ioni de potasiu înseamnă şi o cantitate mai mică de apă intracelulară;

     b) Deformabilitate mai mică a hematiei ca urmare a concentraţiei crescute de hemoglobină (Nash et al.,1983) dar şi ca o consecinţă a modificărilor senescente ale citoscheletului şi a scăderii elasticităţii membranei (Bosch et al., 1994);

     c) Declin metabolic al hematiei, soldat cu reducerea concentraţiei de ATP şi având drept principale consecinţe micşorarea eficienţei pompelor care elimină ionii intracelulari de natriu şi de calciu (Seaman et al., 1980). Creşterea concentraţiei intracelulare de calciu  realizează, prin efectul Gardos (Gardos, 1959), creşterea permeabilităţii membranei pentru potasiu iar prin interacţiunea cu proteinele citoscheletale, poate duce la rigidizarea citoscheletului eritrocitar. Unii autori afirmă, însă, că, dimpotrivă, concentraţia intracelulară de ATP creşte cu 75% la hematiile aflate la numai 10 zile de  data morţii lor prezumate. Astfel, Suzuki & Dale (1988) recoltează hematii de iepure,  asociază pe cale chimică biotin pe suprafaţa lor şi le reinjectează pentru a le recolta după 60 de zile şi a le concentra cu avidină (pentru care hematiile manifestă o mare afinitate). Pe lângă rezultatele referitoare la creşterea concentraţiei de ATP, autorii mai constată că activitatea glicolitică în hematii nu variază cu vârsta, la fel ca şi concentraţia glutationului şi a 2,3-difosfogliceratului.

     d) Modificări la nivelul suprafeţei celulare (printre care cele mai des menţionate sunt  pierderea de acid sialic) şi  consecinţele acestora. Se ştie că acidul sialic este legat de o glicoproteină (glicoforina) şi că, prin multitudinea grupărilor disociabile, oferă celulei o densitate mare de sarcini electrice superficiale negative. Pierderea cu vârsta a acidului sialic ar duce la micşorarea densităţii sarcinilor negative de la suprafaţa hematiei (deşi Bartosz et al., 1993, nu au depistat vreo reducere cu vârsta a densităţii de sarcină la hematiile de iepure) şi ar permite, astfel, fagocitelor să se apropie decisiv de hematiile lipsite acum de forţa de respingere  electrostatică. Iniţial s-a considerat că mobilitatea electroforetică a hematiilor este mai mică la hematiile dense, pentru ca, ulterior, acest fapt să fie desminţit (Seaman et al., 1977), deşi, mult mai recent, Danon & Marikovsky (1988), prin marcarea sarcinilor negative cu particule cationice, confirmă scăderea densităţii acestor sarcini.  Este posibil ca reducerea cantităţii de acid sialic (care este reală) să se datoreze reducerii suprafeţii totale a membranei eritrocitelor dense, deoarece scăderea acidului sialic este, procentual, de acelaşi ordin de mărime cu cea a fosfolipidelor. Este posibil, totuşi, ca acidul sialic să se desprindă de pe o suprafaţă a cărei arie nu se reduce; Gutowski et al. (1991) menţionează, chiar, şi căile prin care se realizează pierderea de acid sialic, şi anume, fie prin intermediul unor  vezicule ce conţin sialoglicoproteine, fie ca acid sialic liber desprins de glicoforina ce rămâne pe suprafaţa membranei. Pe de altă parte, înlăturarea artificială a acidului sialic de pe suprafaţa eritrocitelor de iepure duce, într-adevăr, la sechestrarea  hematiilor respective dar maniera în care hematiile desialicate sunt îndepărtate din circulaţie diferă de cea în care dispar hematiile dense (Balduini et al., 1981).

     Modificările menţionate mai sus se realizează treptat, pe măsură ce hematia înaintează în vârstă. Cauzele primare ale acestor modificări sunt, după părerea unor autori, legate de creşterea vulnerabilităţii la proteaze a proteinelor din banda 3 şi, după alţi autori, de efectele oxidante ale oxigenului transportat de hematii şi, mai ales ale speciilor reactive de oxigen ce îşi fac apariţia ca produşi secundari ai metabolismului celular.

     Este probabil că leziunile oxidative care apar în hematiile dense se explică şi prin diminuarea activităţii enzimelor ce asigură apărarea antioxidantă (superoxid-dismutaza, glutation-peroxidaza, glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza, glutation-reductaza etc.), chiar dacă Piccinini et al. (1995) afirmă că starea de oxidare a proteinelor membranare nu se schimbă cu vârsta, la fel ca şi concentraţia de glutation redus (totuşi, glutationul total scade cu vârsta iar concentraţia relativă a glutationului disulfid creşte).

     Cu timpul, nivelul methemoglobinei ca şi cel al hemicromului (un produs final al hemoglobinei oxidate) cresc. Einsele et al. (1987) incubează hematiile de om, timp de câteva zile, cu glucoză în concentraţie de 20 mM şi constată apariţia methemoglobinei, scăderea activităţii enzimelor glicolitice şi antioxidante şi eliberarea de etan şi butan, considerată, la fel ca şi scăderea nivelului acizilor graşi polinesaturaţi, ca un semn al peroxidării lipidice.

     În hematie îşi fac apariţia pigmenţii fluorescenţi de tipul lipofuscinei, iar numărul de legături transversale dintre moleculele de spectrină creşte. O'Connel & Swislocki (1983) afirmă că are loc o scădere a activităţii enzimatice a spectrin-kinazei în hematiile dense. Mai exact, spectrin-kinaza izolată din hematiile dense este de 10 ori mai puţin eficace în interacţiunea sa cu spectrina izolată din hematiile dense, comparativ cu acţiunea spectrin-kinazei izolate din hematiile mai puţin dense. Cele două tipuri de spectrin-kinază au, însă, o eficienţă egală in interacţiunea lor cu spectrina izolată din hematiile cu densitate mică.

     Creşterea gradului de asociere a hemoglobinei cu membrana eritrocitară a fost considerată drept o posibilă cauză a senescenţei hematiilor. Oxidarea hemoglobinei şi apariţia hemicromului facilitează formarea celui mai agresiv radical liber (oxidrilul neutru); dacă acest radical liber apare în imediata vecinătate a membranei (ca urmare a alipirii hemoglobinei de membrană), probabilitatea unui atac mai eficient asupra fosfolipidelor membranare este mai mare.

     Citoscheletul este şi el implicat în senescenţa hematiilor; un indiciu este faptul că în hematiile hemoglobinopate (“sickle cells”), apar grămezi de ankirină şi glicoforină.

     Numărul grupărilor carboxilice ale proteinelor din banda 2.1 şi 4.1, grupări care sunt esterificate de metionina marcată radioactiv este mai mare în hematiile dense (Galletti et al., 1983). Are loc, de asemenea, o sporire a numărului de reziduri de acid aspartic în configuraţia dextrogiră, ca urmare a unui proces de racemizare a L-aspartatului (Brunauer & Clarke, 1986). Se pare că izomerul dextrogir al acidului aspartic este un acceptor mai bun pentru grupările metil (Clarke, 1985).

     Lowenson & Clarke (1988) apreciază că rezidurile aspartil şi asparginil se numără printre cele mai vulnerabile ţinte ale proteinelor, putând fi atacaţi prin deamidare, izomerizare şi racemizare. Aspartilul D şi L, ca şi izoaspartilul D şi L sunt ţinte pentru reacţia de esterificare a metilului.

     Marcheri de senescenţă ai hematiilor. Modificările ce apar la nivelul suprafeţei hematiilor au valoare de semnal pentru fagocite (monocite şi macrofage). Unii cercetători (Aminoff, 1981) cred, chiar, că desprinderea acidului sialic de pe suprafaţa eritrocitelor poate fi semnalul aşteptat de fagocite pentru atacarea globulelor roşii. Desprinderea rezidurilor de acid sialic de glicoforină ar duce la demascarea antigenului Thomsen-Friedenreich care are în componenţa sa structuri de tip ß-galactozil (Alderman et al., 1981). Aminoff (1988) afirmă că desialicarea glicoforinei expune dizaharidul galacoză-ß(1,3)N-acetilgalactozamină , dizaharid care este recunoscut de celulele sistemului reticuloendotelial.

     Alţi autori cred că semnalul de atac al fagocitelor este dat în urma glicosilării neenzimatice a proteinelor membranare (Vlasara et al., 1982).

     Mulţi cercetători atribuie sfârşitul hematiilor unor procese de natură imunologică iniţiate de apariţia unor antigeni pe suprafaţa hematiilor, urmată de producerea unor anticorpi şi de interacţiunea antigen-anticorp. Beutler (1988) identifică ceasul biologic care controlează distrugerea hematiilor printr-un neoantigen ce îşi face apariţia pe suprafaţa membranei eritrocitare.

     Într-adevăr, hematiile dense au mai multe molecule de anticorpi ataşate pe suprafaţa lor decât hematiile mai puţin dense, chiar dacă numărul acestor molecule nu depăşeşte câteva sute.

     Anticorpii interacţionează cu proteine din banda 3 sau, mai precis, cu polipeptide mai mici ce derivă din acestea şi care sunt depistate numai la hematiile dense (Kay, 1984). In 1988, Kay et al. afirmă că degradarea proteinelor bandei 3, mai curând decât agregarea lor, este evenimentul care iniţiază senescenţa hematiilor.

     Preferinţa anticorpilor se orientează şi pentru carbohidraţii de tipul galactozei sau pentru cei care au structură de -galactozil. Schlepper-Schafer & Kolb-Bachofen (1988) constată că hematiile senescente sunt recunoscute de lecitinele hepatice şi de autoanticorpi datorită expunerii unor diferite reziduri de zaharide sau a unor diverse aranjamente de glicani.

     Vinovată de pieirea hematiilor ar fi şi imunoglobulina G (IgG) din ser care are tendinţa de a se ataşa de hematiile dense (Bosman & Kay, 1988). Shinozuka (1994) se referă la opsonizarea receptorilor pentru fagocite de către autoanticorpi alcătuiţi din imunoglobulina G.

     Dubla semnificaţie a senescenţei eritrocitare. Senescenţa hematiilor are o dublă semnificaţie. Ea poate fi raportată la vârsta hematiei dar şi la vârsta celui de la care au fost recoltate hematiile.

     Se constată că durata de viaţă a hematiilor prelevate de la animalele senescente este aproximativ jumătate din durata de viaţă a hematiilor animalelor tinere. Acest fapt a fost constatat în cazul şoarecilor (Abraham et al., 1978), şobolanilor (Glass et al., 1983), iepurelui (Vomel & Platt, 1981) precum şi la om (Kosower, 1993). Longevitatea scăzută a hematiilor vârstnicilor se explică atât prin calitatea inferioară a materialului biologic din care este alcătuit eritrocitul cât şi prin calitatea inferioară a mediului în care trăiesc hematiile. Factorii extracelulari pot modifica substanţial durata medie de viaţă a hematiilor. Landaw (1988) arată că durata de viaţă a eritrocitelor creşte cu 10% -15 % în condiţiile reducerii temperaturii, ca urmare a hibernării sau în urma hipofizectomiei, tiroidectomiei sau splenectomiei; tratamentul cu tiroxină, în schimb, este capabil să accelereze cu 15 % senescenţa hematiilor.

     Hematiile vârstnicilor conţin cantităţi mai mici de glutation, de glutation reductază şi de superoxid dismutază (Abraham et al., 1978). Durata mai mică a vieţii acestor hematii s-ar explica şi prin capacitatea scăzută de apărare antioxidantă. Cu toate acestea, activitatea peroxidazică, în general, şi cea a glutation-peroxidazei, în particular, sunt crescute în cazul eritrocitelor vârstnicilor. Magnani et al. (1988) constată că durata de viaţă a hematiilor şoarecilor în vârstă de 2 luni este de 12 zile iar în cazul şoarecilor de 2 ani, durata de viaţă scade la 8 zile. Aceste valori nu se schimbă dacă hematiile animalelor vârstnice sunt injectate la animale tinere şi invers. Paradoxal, bătrânii dispun de o populaţie cronologic mai tânără de hematii. Hexochinaza, glucozo-6-fosfat dehidrogenaza şi piruvat-kinaza au activităţi mai mari la vârstnici. Se pare că vârstnicii compensează scăderea longevităţii hematiilor lor printr-un nivel crescut de eritrotopoieză.

     Aşa cum afirmă Margaret Clark (Clark, 1988), este foarte probabil că senescenţa eritrocitului nu este rezultatul unui singur proces ci se realizează simultan pe mai multe căi, astfel încât chiar dacă unul din mecanisme este blocat, alte mecanisme asigură mersul hematiei către senescenţă şi distrugere, mascând contribuţia eventualului mecanism blocat.

     Durata mai mică a vieţii eritrocitului în comparaţie cu longevitatea altor celule sangvine (limfocitul trăieşte ani de zile) se explică, probabil, prin caracterul toxic al încărcăturii pe care o transportă eritrocitul. Kurata et al. (1993) au observat că durata de viaţă a hematiilor aparţinând diferitelor specii de mamifere se corelează pozitiv cu nivelul superoxid-dismutazei, al glutation-peroxidazei şi al glutationului redus. Homeostazia realizată printr-o eritropoieză susţinută se poate dovedi mai avantajoasă organismului decât elaborarea şi menţinerea unor sisteme supradimensionate de apărare antioxidantă iar evoluţia, prin procesele de selecţie naturală, a ţinut, poate,  seama de acest aspect (Clark, 1988).

 

 

Cuprins

Capitolul 8