Capitolul 6

 

          

SENESCENŢA CLONALĂ

 

  

     Definiţia senescenţei clonale

     Prin clonă se înţelege totalitatea generaţiilor succesive de descendenţi ai unei celule, descendenţi ce rezultă prin înmulţire asexuată, adică prin diviziuni celulare neprecedate de fecundare.

     Senescenţa clonală, numită uneori şi senescenţă celulară sau senescenţă replicativă, se manifestă prin modificări ce afectează negativ performanţele biologice ale celulelor unei clone, modificări constând în variaţii din ce în ce mai însemnate ale expresiei unor gene, micşorarea treptată a  numărului  de generaţii celulare în unitate de timp şi, în cele din urmă, încetarea definitivă a diviziunilor celulare.

 

     Senescenţa clonală la organismele unicelulare

     Senescenţa clonală a organismelor unicelulare a fost intens studiată; cercetările lui Smith-Sonneborn (1987) au demonstrat că la unele specii de flagelate care alcătuiesc colonii există atât linii care au viaţă clonală infinită cât  şi linii care manifestă senescenţă clonală.

     Diferitele specii de Paramecium au durate diferite de viaţă clonală; în condiţiile unei hrane abundente, unele clone trăiesc două luni, altele 18 luni iar altele, ani de zile (Sonneborn, 1960). Se pare că există unele specii de Paramecium (de exemplu, Paramecium multimicronucleatum) ale căror reprezentanţi sunt capabili să se multiplice indefinit chiar în lipsa conjugării sau a unei forme de autogamie numită automixis ce  înlocuieşte fertilizarea încrucişată  (Sonneborn & Rofolko, 1957).

     În general, însă, clonele organismelor unicelulare manifestă senescenţă şi pier dacă nu survine la timp un proces de reorganizare nucleară prin conjugare sau prin alte mecanisme (Strehler, 1962).

     Primele semne vizibile de senescenţă la Paramecium aurelia  se manifestă prin modificarea numărului de nuclei, de la doi nuclei cât este normal, la  unu, trei sau patru nuclei.  Apar şi aspecte anormale legate de structura fusului mitotic şi de poziţia intracelulară a unor substructuri. Macronucleul şi aparatul bucal se localizează tot mai aproape de extremităţile protozoarului, fapt ce împiedică despărţirea completă după diviziune a celulelor fiice. La clonele foarte vârstnice (peste 80 de zile), toate aceste manifestări se accentuează pe fondul unor desincronizări ale fazelor diviziunii celulare. Aparatul bucal şi micronucleii îşi încep diviziunea abia după ce se divide macronucleul şi după ce apare planul de diviziune, astfel că nu rare sunt cazurile când unii parameci apar lipsiţi de micronucleu sau de aparat bucal (Sonneborn & Dippel, 1960).

     De regulă, senescenţa clonală provoacă scăderea numărului de urmaşi viabili  (Sonneborn & Schneller, 1960).

     Sonneborn & Schneller (1960) cred că explicaţia senescenţei clonale constă în deteriorarea progresivă a citoplasmei pe măsură ce clona înaintează în vârstă. El se bazează pe faptul că nucleii recoltaţi de la protozoare tinere (cu vârstă clonală mică) pier în câteva zile dacă sunt implantaţi în protozoare vârstnice enucleate.

     În vederea elucidării acestor aspecte, Karino & Hiwatashi (1984) investighează, cu ajutorul transplantului de nuclei, posibila contribuţie a micronucleilor la producerea sterilităţii caracteristice senescenţei clonale terminale. Ei găsesc două categorii de micronuclei în clonele bătrâne de Paramecium caudatum. Prima categorie cuprinde micronuclei care pot funcţiona normal într-o citoplasmă tânără, iar cea de a doua categorie este formată din micronuclei ce nu reuşesc acest lucru. Autorii presupun că în primul caz sterilitatea clonei senescente s-a datorat degradării macronucleului şi/sau a citoplasmei iar al doilea caz îi face să presupună că micronucleii transplantaţi sunt deja lezaţi de citoplasma donatorului. într-adevăr, micronucleii tineri încetează curând să funcţioneze când sunt transplantaţi în celulele unei clone senescente.

     Ambele situaţii sugerează că senescenţa clonală nu pare a fi generată de micronuclei.

     Aufderheide (1984) încearcă să stabilească partea de contribuţie a macronucleului şi a citoplasmei în producerea senescenţei clonale la Paramecium tetrautrelia. El a transferat citoplasma unor celule din clone tinere în celulele unei clone bătrâne precum şi în sens invers. în nici unul din cazuri nu s-a constatat o modificare statistic semnificativă a duratei de viaţă a clonelor şi acest fapt pledează pentru inexistenţa unui efect citoplasmic asupra senescenţei clonale.

     Ceva mai târziu, Aufderheide (1986) studiază contribuţia macronucleului la instalarea fenomenului de senescenţă clonală, injectând macronuclei prelevaţi de la celule ale unei clone tinere de Paramecium tetraurelia în celule aparţinând unei clone de o vârstă mai mare; ei constată că durata de viaţă a celei din urmă clone creşte în mod semnificativ. Paradoxal, viaţa clonei se prelungeşte (deşi într-o foarte mică măsură), chiar dacă macronucleii transplantaţi aparţin celulelor unei clone mai vârstnice.

     Observând că potenţialul de proliferare al macronucleului prelevat de la un donor nu pare a fi modificat ca urmare a transplantării lui în celule gazdă de vârste clonale diferite de cea a donorului, Aufderheide afirmă că 'macronucleul îşi reaminteşte vârsta după transplantare'.

     Din datele prezentate rezultă, deci, că senescenţa clonală a paramecilor pare a fi determinată în primul rând de macronuclei.

 

     Modificări cromozomale în senescenţa clonală

     Există multe date care pledează pentru implicarea specifică a segmentelor terminale ale ADN-ului cromozomal în fenomenele de senescenţă clonală.

     Spre deosebire de cromozomii circulari ai bacteriilor, cromozomii eucariotelor sunt formaţi din molecule liniare de ADN.

     Fiecare cromozom al celulelor eucariote are la cele două extremităţi ale sale o anumită cantitate de material nuclear inclus în aşa numitele telomere. Telomerele au menirea de a permite replicarea completă a ADN-ului purtător de gene aflat la periferia cromozomilor, de a  împiedica fuziunea extremităţilor noilor cromozomi, atât unele cu celelalte cât şi cu diferite regiuni mai centrale ale cromozomilor,  precum şi de a contribui la fixarea cromozomilor pe membrana nucleară.

     Lanţul ADN al unui cromozom aparţinând unui organism monocelular se sfârşeşte la cele două extremităţi ale  cromozomului printr-un număr de secvenţe repetitive de tipul TnGm, unde T reprezintă timina şi G este guanina. Aceste secvenţe se repetă de un număr ori şi, împreună cu lanţul paralel complementar format din secvenţele repetitive AnCm (unde A este adenina şi C este citozina), alcătuiesc telomerul. Secvenţa TG se află în lanţul a cărui extremitate 3' se află în acel telomer (Murray, 1990). La vertebrate, secvenţa repetitivă este de tipul  TnAGm.

     Existenţa unor secvenţe simple de ADN care se repetă nu este neobişnuită; în multe lanţuri de ADN asemenea secvenţe sunt răspândite din loc în loc în structura cromozomului sau apar în blocuri compacte în vecinătatea centromerelor, în special în regiunea prin care cromozomii se vor ataşa de fusul mitotic.

     Ceea ce este mai neobişnuit pentru telomer este că ADN-ul telomeric nu se replică în manieră semiconservatoare, ca orice alt ADN. Se ştie că enzimele care sintetizează ADN fac această operaţie într-o singură direcţie şi anume, de la capătul 5' către capătul 3' al lanţului de ADN aflat în formare.

     La nivelul telomerului, acest fapt nu ridică probleme pentru capătul 5' dar riscă să genereze o pierdere de informaţie la capătul 3' (figura 11).

       Fig.11 - În timpul replicării ADN-ului, cele două lanţuri vechi (linii continue) sunt folosite ca matriţe pentru lanţurile noi. Deoarece nu se poate iniţia un lanţ nou chiar la capătul matriţei, va lipsi un segment de ADN  la capătul 5' al noului lanţ; dacă această lipsă nu va fi completată, macromolecula de AND va deveni din ce în ce mai scurtă după fiecare nouă replicare

      Acest pericol poate fi înlăturat datorită unei enzime numită telomerază, care adaugă o secvenţă repetitivă TnGm la capetele 3' şi furnizează astfel o matriţă mai lungă pentru noul capăt 5' ce se va forma. (fig.12)

     Se pune, fireşte, întrebarea, cum reuşeşte telomeraza să sintetizeze şi să adauge exact secvenţa necesară şi specifică tipului de celulă, fără a avea la îndemână matriţa unui lanţ complementar de ADN.

     Blackburn şi Greider (citat în Cech, 1988) au ajuns la concluzia că telomeraza conţine propria sa matriţă şi, într-adevăr, ei descoperă în structura acestei enzime un mic fragment de ARN conţinând, în cazul telomerazei de Tetrahymena, 159 de baze azotate. Ei identifică secvenţa CAACCCCAA care, după cum se vede, este complementară pentru o secvenţă şi jumătate de tip T2G4.

     Această concluzie a fost confirmată şi în cazul telomerazei de Euplotes, unde s-a identificat secvenţa CAAAACCCCAAA care, la rândul ei, este complementară unei secvenţe şi jumătate ce există în materialul telomeric al acestei celule. Se confirmă, astfel, că este vorba de o enzimă ribonucleoproteică (Cech, 1988) şi se demonstrează că sinteza ADN se poate face şi prin alt mecanism decât prin cel propus de Watson şi Crick, adică pe baza perechilor A-T şi G-C.

     Modul în care telomeraza reuşeşte să evite pierderile de ADN telomeric cu ocazia replicării este prezentat în figura 12 (după Gall, 1990).

 

       Fig.12 - Telomeraza extinde capătul 3' al lanţului vechi de ADN, construind o matriţă suplimentară pentru extremitatea 5' a noului lanţ de ADN (vezi şi figura 11)

 

     Deşi telomerele sunt menite să asigure stabilitatea cromozomilor, se obişnuieşte să se spună că ele reprezintă un adevărat 'călcâi al lui Ahile' (Harley et al., 1990) pentru ADN-ul cromozomal, deoarece pot sta la originea replicării incomplete a acestuia.

     Încă din 1973, când Olovnikov (citat în Harley, 1991) a sugerat că după fiecare diviziune celulele pierd un fragment de ADN din cauza incapacităţii ADN-polimerazei de a replica în întregime ADN-ul telomeric, au apărut tot mai numeroase lucrări care sprijină implicarea ADN-ului telomeric în fenomenele de senescenţă clonală; unele dintre ele compară telomerele, care se scurtează proporţional cu înaintarea în vârstă a clonei, cu nişte ceasuri mitotice.

     Faptul că macronucleul protozoarelor este considerat ca principal vinovat de senescenţa clonală poate fi explicat şi prin ipoteza scurtării telomerelor deoarece, spre deosebire de micronuclei, care conţin cromozomi întregi, macronucleii conţin fragmente de cromozomi. Gradul de fragmentare diferă de la specie la specie, atingând un maxim la Oxytrichia şi la Euplotes unde, practic, fiecare genă se află pe un singur fragment de ADN. Aceste fragmente, deşi foarte mici în comparaţie cu cromozomii obişnuiţi, sunt înzestrate cu telomere la ambele capete, astfel încât telomerele reprezintă o parte foarte mare din materialul nucleic al macronucleului în comparaţie cu situaţia existentă în micronuclei. Din această cauză, macronucleul ar fi mai sensibil la fenomenul de scurtare a telomerelor ce survine odată cu înaintarea în vârstă a clonei (Gall, 1990).

     Şi la alte unicelulare telomerele par a juca un rol important în senescenţa clonală.

     Lundblad & Szostak (1989) izolează un mutant de drojdie caracterizat de o scădere progresivă a lungimii telomerelor ca şi de o creştere a frecvenţei pierderilor de cromozomi. Acest mutant posedă o genă numită EST1 (Ever Shorter Telomeres 1) ale cărei alele sunt viabile dar manifestă senescenţă clonală. Pierderea treptată a unor secvenţe esenţiale ale telomerelor duce la o descreştere progresivă a stabilităţii cromozomiale.

     Numeroase lucrări demonstrează că senescenţa clonală a organismelor monocelulare se însoţeşte şi de leziuni ale acizilor nucleici. Analiza ADN extras de la celule de Paramecium tetraurelia aparţinând unor clone în vârstă de 4, 15 şi 27 de zile (corespunzând generaţiilor cu numerele 16, 60 şi 108) a pus în evidenţă un proces de acumulare treptată de leziuni, printre care şi rupturi sau întreruperi ale lanţurilor complementare de ADN. Holmes şi Holmes (1986), care au publicat aceste rezultate,  consideră că, cel puţin la aceste tipuri de parameci, acumularea acestor leziuni poate fi chiar cauza senescenţei clonale.

 

       Senescenţa clonelor unor celule somatice ale organismelor pluricelulare

      Într-o lucrare intitulată 'Despre viaţa eternă a ţesuturilor în afara organismului', Alexis Carrel (citat în Strehler, 1962) acreditează în 1912 o teorie care va rezista circa o jumătate de secol.

     Carrel demonstra că fibroblaştii recoltaţi din inima embrionilor de pui de găină se multiplică nelimitat dacă sunt cultivaţi in vitro. Ideea că in vitro culturile de celulele animale trăiesc veşnic a marcat profund concepţiile privind senescenţa, determinând pe mulţi cercetători să-şi concentreze eforturile în căutarea acelor substanţe existente în mediul intern al organismului sau a acelor interacţiuni celulare care limitează potenţialul de proliferare al celulelor somatice şi determină îmbătrânirea şi moartea lor.

     În 1961, Hayflick şi Moorhead (Exp.Cell.Res. 25, 585, citat în Hayflick, 1974) spulberă mitul imortalităţii celulelor cultivate in vitro, sugerând că rezultatele lui Carrel se referă la celule care, pe parcursul diviziunilor succesive, au devenit anormale şi s-au transformat în celule neoplazice. în realitate, celulele normale ale vertebratelor au o capacitate limitată de proliferare atât in vitro cât şi in vivo.

     Hayflick (1974) afirmă că limitarea potenţialului de multiplicare este o expresie a fenomenului de senescenţă clonală la nivel celular. El a observat că celulele diploide prelevate din embrionul uman şi cultivate in vitro se multiplică activ circa un an, după care ritmul mitozelor se încetineşte treptat până ce cultura degenerează complet şi moare.

     Într-o lucrare publicată în 1984, Hayflick enumeră câteva concluzii cu privire la senescenţa clonală:

     -există o relaţie inversă între potenţialul de dublare al celulelor prelevate dela un donor şi vârsta acestuia

     -există o relaţie direct proporţională între potenţialul de dublare al fibroblaştilor embrionilor unei anumite specii şi durata maximă de viaţă caracteristică acelei specii

     -potenţialul de dublare al celulelor prelevate dela pacienţi cu sindroame de îmbătrânire accelerată este mai mic în comparaţie cu situaţia existentă la oameni sănătoşi

     -fibroblaştii proveniţi dela specii cu durată mare de viaţă au o capacitate sporită de reparare a leziunilor suferite de ADN

     -centrul care determină numărul maxim de dublări al unei celule se află în nucleu.

     Natura oferă posibilitatea comparării ratei de senescenţă clonală a celulelor unui organism cu rata de senescenţă a individului, chiar şi în cazul organismelor unicelulare. Aşa cum s-a mai menţionat, există un protozoar suctorian, numit Tokophrya infusionum, care se înmulţeşte prin înmugurire şi care, după sfârşitul perioadei reproductive, îmbătrâneşte şi moare, viaţa lui fiind de aproximativ o lună.

     Karakashian et al. (1984) constată că, deşi clonele îmbătrânesc mult mai lent decât indivizii, există o relaţie clară între vârsta clonei şi vârsta individului. Viaţa unui protozoar aparţinând unei clone bătrâne este mult scurtată. Cele două tipuri de senescenţă se dovedesc a fi, într-un fel, cuplate.

     Într-o lucrare de sinteză, Van Gansen & Van Leberghe (1988) prezintă câteva concluzii cu privire la efectele senescenţei clonale a fibroblaştilor rozătoarelor şi anume, scăderea plasticităţii cromatinei, modificarea organizării filamentelor citoplasmatice şi modificarea organizării matricei extracelulare.

     Fibroblaştii proveniţi din ţesutul uman fetal realizează un număr de aproximativ 50 de dublări în circa 6 luni. Numărul de dublări celulare variază de la un tip de celulă la altul, dar depinde şi de specia căreia îi aparţine organismul, fiind, în linii  mari, proporţional cu durata maximă de viaţă a reprezentanţilor speciilor respective, aşa cum se vede în tabelul următor (Hayflick, 1984) care se referă la fibroblaşti fetali aparţinând mai multor specii de animale:

 

Specie

Număr de dublări

Durata maximă de viaţă

Broască ţestoasă 90 - 125 175     ani
Om  40 -   60 110     ani
Găină 15 -   35  30     ani
Şoarece 14 -   28 3,5   ani

 

    Dacă o clonă provenită dintr-un fibroblast uman (plămân fetal - linia WI-38) este capabilă de 50 de dublări, acelaşi număr de dublări va fi realizat şi dacă la un moment dat, o generaţie celulară este îngheţată în azot lichid un interval de timp care poate fi chiar 23 de ani, aşa cum au evidenţiat experienţele întreprinse în acest sens (Hayflick, 1985). Numărul de dublări ce se mai produc după dezgheţare este egal cu diferenţa dintre numărul total de dublări (50) şi numărul de dublări deja efectuate până în momentul îngheţării.

     Nu trebuie crezut, însă, că potenţialul de dublare al celulelor cultivate este atât de precis stabilit pentru oricare celulă. Jones et al. (1985) măsoară potenţialele proliferative ale celor două celule ce rezultă dintr-o diviziune. Studiind numeroase asemenea perechi mitotice, ei constată că există o fracţiune semnificativă de clone care au un număr diferit de dublări, ceea ce înseamnă că există o componentă stochastică importantă în punerea în valoare a potenţialului proliferativ moştenit.

     La fel ca la organismele monocelulare, se pare că şi senescenţa celulelor somatice este însoţită (dacă nu chiar provocată) de diminuarea până la dispariţie a materialului nucleic telomeric.

     Se ştie că la vertebratele superioare, inclusiv la om, secvenţa de baze care se repetă este T2AG3/ A2TC3 (sau TTAGGG/ AATCCC) spre deosebire de monocelulare unde se întâlnesc secvenţele T2G4/ A2C4 (sau TTGGGG/ AACCCC) la Tetrahymena şi T4G4/ A4C4 (sau TTTTGGGG/ AAAACCCC) la Oxytrichia şi Euplotes  (Gall, 1990).

     Lungimea telomerelor umane (TTAGGG)n variază de la celulă la celulă; în cazul celulelor sangvine, lungimea medie este de 10.000 de perechi de baze azotate (Kipling & Cooke, 1990). în general telomerele umane au între 2.000 şi 20.000 de perechi de baze (Wilkie et al., 1990), în timp ce la şoarece lungimea telomerelor ajunge la 150.000 de perechi de baze (Kipling & Cooke, 1990). La şoareci există mari variaţii de lungime a telomerelor de la o familie la alta, sugerând o neobişnuită rată a mutaţiilor la acest animal (Kipling & Cooke, 1990).

     Este greu de spus dacă aceste telomere lungi ale şoarecilor reprezintă rezultatul unui proces de selecţie naturală sau este o simplă variaţie neutră din punct de vedere selectiv.

     Harley et al.(1990) studiază evoluţia culturilor de fibroblaşti umani in vitro până ce acestea ajung la ultima lor diviziune, urmărind la fiecare pasaj dimensiunea telomerelor. Lungimea telomerelor scade, în medie, cu 2000 de perechi de baze, ceea ce corespunde unei pierderi medii de 50 de perechi de baze la fiecare diviziune celulară. Este vorba de o pierdere reală de material nucleic şi nu de o redistribuire a acestuia, dovadă fiind scăderea cantităţii totale de ADN telomeric.

     La aceeaşi concluzie ajung şi Levy et al. (1992) care, plecând dela pierderea a 50 pb pe generaţie, apreciază ca fatală pentru clonă pierderea de 4000 de pb la cea de a 80-a generaţie, mai ales că la unele telomere pierderea poate fi încă şi mai mare, deoarece cifra de 50 de pb este o valoare medie calculată pentru toate telomerele genomului.

     Vaziri et al. (1993) determină pierderile de material telomeric la limfocite provenind de la oameni sănătoşi şi de la pacienţi cu sindrom Down, constatând că în cel de al doilea caz, se pierd 133 plus sau minus 15 pb pe an faţă de numai 41 plus sau minus 7 pb pe an la oamenii sănătoşi. Tot ei calculează că, în culturi in vitro, limfocitele indivizilor normali pierd aproximativ 120 de perechi de baze la o dublare celulară, cifră comparabilă cu cele obţinute de la alte celule somatice cultivate.

     Cercetările grupului lui Vaziri sunt importante şi pentru faptul că sindromul Down determină, printre altele, o accelerare a îmbătrânirii. Şi în cazul sindromului Werner, care produce îmbătrânirea prematură, fibroblastele prelevate de la pacienţi cu acest sindrom au o senescenţă clonală accelerată. Thweatt & Goldstein (1993) presupun că motivul este o mutaţie într-o genă represoare care declanşează o exprimare prematură a unor inhibitori ai sintezei de ADN.

     Deoarece pierderea de ADN telomeric observată în senescenţa clonală in vitro ar putea avea loc şi in vivo pe măsură ce celulele somatice se divid, este important să se determine eventuala dependenţă a lungimii telomerelor de vârsta organismului investigat.

     Kruk et al. (1995) pun la punct o metodă capabilă să detecteze leziunile apărute la nivelul telomerelor umane precum şi măsura în care ele sunt reparate. Ei constată că telomerele fibroblastelor prelevate de la donatori sănătoşi vârstnici sau de la  bolnavi cu sindroame de îmbătrânire precoce Werner sunt mai scurte iar ritmul reparării leziunilor produse la nivelul lor este mai lent (în comparaţie cu situaţia constatată la tineri sănătoşi). Telomerele celor cu sindrom Altzheimer nu sunt, însă, serios afectate.

     Scurtarea telomerelor cu vârsta, atunci şi acolo unde ea există, poate avea o semnificaţie biologică legată de întregul proces de senescenţă al organismului, chiar dacă Khaliavkin (1994) susţine contrariul, bazându-se pe faptul că fibroblaştii umani cultivaţi timp de un an nu şi-au pierdut capacitatea de proliferare.

     Deoarece telomerele fibroblastelor tinere au 4.000 de perechi de baze, o pierdere de 2.000 pb echivalează cu  o înjumătăţire a numărului lor, ceea ce, evident, nu este o pierdere neglijabilă.

     Lucrurile apar într-o altă lumină dacă ţinem seama de faptul că fiecare celulă umană are 92 de telomere ale căror lungimi sunt în medie de 4.000 de pb, unele putând fi mult mai scurte; pentru acestea din urmă, pierderea a 2.000 de perechi de baze poate însemna dispariţia lor totală iar un cromozom fără telomere poate declanşa senescenţa clonală şi oprirea diviziunii. Este cunoscut faptul că spre sfârşitul vieţii unei clone cultivată in vitro, apar cromozomi dicentrici a căror existenţă se explică prin pierderi parţiale sau totale de telomere (Harley, 1991).

     De regulă, telomerele celulelor germinale sunt mai lungi decât cele ale celulelor somatice. De exemplu, un spermatozoid uman are telomere lungi de 9.000 pb, adică mai mult decât dublu în comparaţie cu telomerele fibroblaştilor (Harley, 1991; Hastie et al.,1990).

     Harley et al. (1990) apreciază lungimea telomerelor la 10.000 de baze în celulele sangvine şi 15.0000 pb la spermatozoizi. Telomerele celulelor somatice recoltate de la un făt de 26 de săptămâni au doar cu 1.000 - 2000 pb mai puţin decât telomerele spermatozoizilor. Lungimea telomerelor celulelor epiteliale din colonul unor oameni în vârstă este mult mai mică decât cea observată în cazul spermatozoizilor (cu 12.000 pb) iar la celulele sangvine, cu 14.000 pb.

     Dacă celulele fătului au deja în urma lor 20-50 de diviziuni succesive, celulele mucoasei colonului şi cele ale celulelor sangvine aparţinând persoanelor în vârstă de peste 60 de ani au o istorie de câteva sute sau mii de diviziuni. Rezultă că reducerea lungimii telomerelor este mai mult sau mai puţin proporţională cu numărul de diviziuni prin care a trecut celula respectivă.

     Lindsey et al.(1991) constată, studiind ADN-ul telomeric în celulele epiteliale din pielea a 21 de oameni având vârste între 0 şi 92 de ani, că atât lungimea telomerelor cât şi cantitatea de material telomeric scad semnificativ cu vârsta.

     În schimb, Kipling et al. (1990) nu constată o reducere semnificativă a dimensiunii telomerelor odată cu înaintarea în vârstă a şoarecilor. Animalele în vârstă de 17 luni se caracterizează printr-o distribuţie normală a lungimii telomerelor. Acest rezultat, alături de faptul că speciile caracterizate printr-o durată redusă de viaţă au telomere mult mai lungi decât cele ale vieţuitoarelor cu viaţă lungă, sugerează că scurtarea telomerelor nu poate fi cauza senescenţei in vivo. Scurtarea telomerelor la oamenii bătrâni poate fi considerată mai curând un efect al senescenţei decât o cauză a ei. Luke et al. (1994) constată că la nonagenari atât telomerele cât şi centromerii au o stabilitate remarcabilă şi, într-o oarecare măsură, surprinzătoare în raport cu date similare publicate; ei constată, totuşi, că telomerele nonagenarilor sunt mai scurte decât cele ale celor de 40 de ani. De altfel, gradul scurtării telomerelor variază mult de la un om la altul. Slagboom et al. (1994) studiază acest aspect la peste 100 de perechi de gemeni şi afirmă că probabilitatea ca diferenţele să fie ereditare (determinate genetic) este de 78%. Ei calculează că telomerele pierd, în medie,  31 perechi de baze pe an.

     O altă problemă importantă este absenţa expresiei telomerazei (Harley et al., 1990; Hastie et al.,1990) la celulele somatice dar nu şi la celulele germinale care, după cât se ştie, sunt nemuritoare.

     De asemenea, Levy et al.(1992) consideră că celulele eucariote capabile de un număr nelimitat de diviziuni dispun de telomerază pe care o folosesc pentru a-şi menţine constantă lungimea telomerelor şi pentru a contracara, astfel, replicarea incompletă a ADN-ului terminal, în timp ce în celulele care îmbătrânesc clonal nu s-a identificat telomeraza.

     Nu este pe deplin clar modul în care sunt implicate telomerele în diviziunea nucleară şi celulară. Telomerele au fost găsite adesea în lamina aflată imediat sub membrana nucleară. Complexul proteină-ADN-telomeric realizează forme polimerice extinse. Secvenţele sintetice de ADN telomeric sunt interconectate cu lamina nucleară prin filamente formate din vimentin, ceea ce indică posibila asociere a telomerelor cu lamina nucleară. Acest fapt poate avea consecinţe în segregarea cromozomilor acentrici şi în diviziunea macronucleului protozoarelor, aşa cum s-a constatat că se petrece în cazul speciei Tetrahymena (Guo-Liang et al., 1990).

     În aceeaşi ordine de idei, Pienta et al.(1992) susţin că deşi matricea nucleară, în calitatea ei de citoschelet dinamic al nucleului, este apreciată de unii autori ca jucând un rol critic în procesele de îmbătrânire, în realitate ea nu se modifică semnificativ în senescenţă, în ciuda faptului că nucleul celulelor bătrâne se hipertrofiază. Dell'Orco & Whittle (1994) constată, totuşi, unele modificări ale matricei nucleare pe care le definesc ca fiind o exprimare defectuoasă a proteinelor ce o alcătuiesc.

     Nu trebuie să se înţeleagă din cele de mai sus că singura modificare a acizilor nucleici întâlnită în senescenţa clonală este scurtarea telomerelor. în senescenţa clonală a fibroblaştilor umani şi a limfocitelor de şobolan apar, cu o frecvenţă ce creşte cu vârsta, atât in vitro cât şi in vivo, forme circulare de ADN extracromozomal (Kunisada et al., 1985), în mod special, forme circulare cu un contur mai mare de metri şi care conţin mai mult de 1500 de perechi de baze. Autorii găsesc şi forme mai mici de 0,5 metri în fibroblaştii vârstnicilor precum şi în cele ale celor cu sindrom Werner. Formele circulare de ADN sunt considerate a fi produşi ai rearanjării ADN-ului cromozomal sau rezultate ale unor amplificări genice ce au loc în cromozom.

     Unii autori presupun participarea ADN-ului mitocondrial în procesul de senescenţă clonală; se pare, însă, că acest fapt nu se manifestă întotdeauna, aşa cum susţin White & Bunn (1985) care analizează probe de mt-ADN prelevate de la fibroblaşti aflaţi la cea de a 27-a, 41-a şi 60-a dublare (numărul maxim de dublări este 63).  în capitolul următor pot fi găsite mai multe detalii privind procesul de senescenţă al ADN-ului şi al cromozomilor atât  în celulele mitotice cât şi în cele post-mitotice.

 

     Senescenţa celulară şi cancerul   

     Ipoteza conform căreia senescenţa clonală a celulelor diploide este un mijloc de protecţie împotriva proliferării necontrolate a celulelor canceroase a fost formulată pentru prima dată de Dykhuizen în 1974 (citat în Cairns & Logan, 1983).

    Cairn şi Logan (1983) dezvoltă această idee afirmînd că 'unul dintre programele menite să protejeze întregul organism împotriva invaziei unor clone necontrolate este senescenţa programată, care intervine în mod normal după un număr de generaţii celulare succesive. Această barieră trebuie depăşită ori de câte ori se dezvoltă un cancer sau se stabileşte o linie imortală in vitro'.      

     Holiday (1983) pune la îndoială ipoteza lui Dykhuizen. Deoarece potenţialul de creştere al fibroblaştilor este apreciat la 60 de dublări, el calculează că o celulă va produce în final 260 celule, adică 1018 celule în greutate totală de 1000 de tone. Este clar că o clonă a unei celule canceroase poate ucide organismul gazdă în mult mai puţine dublări, deci fără a fi în situaţia de a depăşi potenţialul maxim de dublare şi a trece, astfel, bariera impusă de senescenţa clonală.

     De altfel, celulele de pui de găină infectate cu virus oncogenic produc tumori maligne, fără ca linia celulară astfel modificată să fie nemuritoare. Pe de altă parte, fibroblaştii prelevaţi din tumori, în cazul sindroamelor Bloom, Falconi sau Werner şi cultivaţi in vitro se dovedesc a avea un potenţial de multiplicare mult mai mic decât 60 de dublări.

     Admiţând că senescenţa este programată genetic, se poate pune întrebarea de ce  este ea accelerată în aceste forme de cancer; pe de altă parte, dacă senescenţa este o barieră în calea cancerului, de ce nu protejează ea indivizii împotriva tuturor formelor de creştere tumorală?

     Faptul că celulele încetează la un anumit moment dat să prolifereze poate avea două explicaţii posibile: (i) există o determinare genetică a unor evenimente succesive, riguros programate, care culminează cu blocarea diviziunii celulare sau (ii) senescenţa se produce prin acumulare treptată de macromolecule defecte care, de asemenea, în final, pot bloca multiplicarea.

     Trebuie avută în vedere şi posibilitatea ca anumite linii celulare nemuritoare să dea naştere, din când în când, unor clone senescente, care ar putea deveni majoritare, diluând clona nemuritoare până la dispariţie. Este, de asemenea, posibil, ca o clonă să aibă o singură linie celulară nemuritoare, celelalte subclone având potenţial finit de multiplicare. întreruperea din diferite motive a continuităţii liniei nemuritoare transformă întreaga clonă într-o clonă muritoare.

     Faptul că potenţialul finit de multiplicare al celulelor somatice este în acelaşi timp un factor ce limitează proliferarea dar şi o cauză a senescenţei clonale, a determinat pe mulţi cercetători să examineze mai atent interelaţiile la nivel celular ale senescenţei şi cancerului.

     Philipson şi Sorentino (1991) menţionează că reglarea creşterii celulare se poate realiza pe două căi, în funcţie de ceea ce înţelegem prin starea normală a celulelor. Dacă celulele sunt în mod natural lipsite de tendinţa spontană de a se divide, atunci este nevoie de un factor de creştere care să inducă diviziunea. Dacă, dimpotrivă, tendinţa de multiplicare celulară este o caracteristică a stării naturale a celulei, atunci încetarea multiplicării este o restricţie impusă de sistem, celula urmând să primească semnale care să determine încetarea diviziunii. Asemenea semnale s-ar putea primi şi din exteriorul celulei şi ar determina finalul diferenţierii celulare, senescenţa şi chiar supresia creşterii tumorale, dacă aceasta are loc.

     Mulţi autori vorbesc de imortalizarea celulară prin intermediul oncogenelor (prin imortalizare a celulelor se înţelege dobândirea de către acestea a unui potenţial nelimitat de multiplicare, adică generarea unei clone care să evolueze fără senescenţă sau crize de creştere). Imortalizarea ar fi efectul unor gene specifice care previn senescenţa in vitro fără, însă, a fi exprimate in vivo (Pillow & Bendix, 1985).

     Este posibil  ca o celulă, de-a lungul diferenţierii ei treptate, să nu mai poată întrerupe o genă reglatoare, celula continuând să exprime aceste gene reglatoare precum şi genele ale căror expresii le controlează până când celula este blocată de însăşi  starea ei de a exprima gene nepotrivite şi nu-şi mai poate termina diferenţierea (Pillow & Bendix, 1985). 

     Nu trebuie exclusă nici posibilitatea dediferenţierii celulei somatice şi transformarea ei într-o celulă în stare cvasi-embrionară, asemănătoare celulelor germinale. Prin dediferenţiere s-ar putea ca celula să devină capabilă să evite acumularea de macromolecule defecte care, în celulele somatice diferenţiate par a fi cauza îmbătrânirii şi a morţii. Se consideră că dispun de o capacitate nelimitată de diviziune (sunt nemuritoare) celulele germinale, celulele neoplazice precum şi celulele devenite astfel prin transformări provocate de agenţi cancerigeni sau de virusuri. Unii autori susţin că malignizarea presupune două etape succesive: imortalizarea şi malignizarea propriu-zisă (Kuroki & Huh, 1993).

       Bryan et al. (1995) se întreabă dacă activarea telomerazei în celulele umane este necesară pentru dobândirea imortalităţii acestora. Concluzia lor este că menţinerea lungimii constante a telomerelor este o condiţie necesară pentru imortalizarea liniei celulare respective, dar că la acest rezultat se ajunge nu numai prin reactivarea telomerazei ci şi printr-un alt mecanism încă neidentificat.

     Fenomenul de imortalizare a celulelor somatice a fost studiat şi cu ajutorul tehnicilor de fuziune celulară. Au fost efectuate fuziuni între celule muritoare şi celule nemuritoare pentru a se putea constata dacă imortalitatea clonală este dominantă sau recesivă.

     Hibridizarea unei celule normale (muritoare) cu celule HeLa sau cu celule transformate prin SV40 (virus simian) a arătat că fenotipul imortalităţii este recesiv, ceea ce înseamnă, desigur, că senescenţa este dominantă.

     Pereira-Smith (1992) constată că hibrizii produşi prin fuziunea celulelor normale cu cele nemuritoare au un potenţial proliferativ limitat. Introducerea prin fuziune microcelulară a unui cromozom 4 uman normal la celulele carcinomului cervical HeLa este suficientă pentru a induce senescenţa în linia nemuritoare. Sasaki et al. (1994), introducând diferiţi cromozomi în celule tumorale, induc în acestea senescenţă clonală. Autorii menţionaţi identifică doi cromozomi specifici şi mapează peste 10 gene implicate. Toate aceste rezultate experimentale conduc la concluzia conform căreia senescenţa clonală rezultă din mecanisme genetic active.

     Fuziunea a două celule nemuritoare duce, uneori, la hibrizi nemuritori, alteori la hibrizi cu potenţial limitat de proliferare. Fuziunile efectuate între celule aparţinând unui număr de peste 30 de linii nemuritoare au permis identificarea a 4 grupe de complementaritate care conduc la hibrizi senescenţi. Rezultă că imortalizarea presupune intervenţia a cel puţin 4 gene diferite (Goletz et al., 1994). Pentru ca o celulă să evite senescenţa clonală este necesar ca genele ce o provoacă să fie pierdute sau inactivate.

     Hensler et al. (1994) introduc cromozomul uman 1 în celule din linii nemuritoare aparţinând grupei C din cele 4 grupe complementare mai sus menţionate şi obţin scăderea capacităţii proliferative. Efectul nu se produce la celelalte grupe. Mai mult, încă, dacă cromozomul 1 este lipsit de braţul q, el nu mai poate induce senescenţa clonală. Prin urmare, pe braţul q se află o genă sau un set de gene care sunt alterate în celulele din grupa C şi care par a fi implicate în senescenţă.

     Aceste rezultate surprinzătoare au fost interpretate de Pereira-Smith ca dovezi în favoarea ipotezei senescenţei programate, în sensul că, acolo unde anumite disfuncţii în aplicarea acestui program duc la nemurirea celulară, hibrizii pot avea şanse de restabilire prin complementare a acestui program de senescenţă şi moarte.

     Ryan et al. (1994) neagă, însă, posibilitatea ca prin fuziunea unor celule din linii nemuritoare să se obţină hibrizi senescenţi; în orice caz, ei nu au reuşit aceasta şi explică rezultatele diferite ale altor autori prin deteriorarea culturilor, ca urmare a toxicităţii drogurilor utilizate pentru selectarea liniilor celulare.

     într-un articol publicat în 1993, Newbold et al.  susţin că senescenţa in vitro a celulelor de mamifere este controlată de un grup mic de gene, dintre care una sau mai multe sunt victime ale unei deleţii funcţionale în procesul de imortalizare.

     Wistrom şi Villeponteau (1992) folosesc procedeul hibridizării pentru a identifica genele preferenţial exprimate în fibroblaştii senescenţi, gene pe care le numesc gene asociate senescenţei (SAG). Autorii constată că expresia acestor gene este de trei ori mai mare în fibroblaştii senescenţi şi creşte proporţional cu încetinirea  ritmului de multiplicare. Ei au arătat că SAG este o genă activă în aproape toate tipurile de celule testate şi este păstrată de procesul selecţiei naturale de-a lungul evoluţiei.

    În ultimii ani au fost identificate o serie de proteine implicate în procesul imortalizării celulare. Wadhwa et al. (1994) izolează o proteină de 66.000 de daltoni pe care o numesc mortalin şi care, dacă este localizată în citoplasmă este capabilă să inducă senescenţa (localizarea ei perinucleară nu reuşeşte aceasta). Liu et al. (1994) descriu proteina prohibitin iar Schipper et al. (1994) se referă în acest sens la proteina terminin; aceste proteine  se exprimă în fibrocitele senescente.

     Wang (1992) identifică antigenul S6 asociat cu ADN în nucleii celulelor aflate în curs de multiplicare (dar nu şi în cei ai celulelor senescente). Antigenul S6 este distribuit uniform în nucleoplasmă cu excepţia nucleolilor şi este asociat cu cromozomii în cazul celulelor mitotice. Tratamentul cu ARN-ază nu inhibă colorarea cu anticorpi a acestor nuclei, în timp ce ADN-aza reuşeşte aceasta. Antigenul S6 este o proteină de 50.000 daltoni. Experienţele arată că încetarea expresiei genice manifestată prin dispariţia antigenului S6 este asociată cu faza terminală a diferenţierii şi cu declanşarea senescenţei.

     Kirkwood (1991) admite că limitarea proliferării celulare are o cauză imediată care implică, probabil, o formă de control genetic activ, dar crede că, în cele din urmă, explicaţia senescenţei clonale trebuie căutată în teoria evoluţiei speciilor, ce sugerează că procesul de senescenţă nu este programat activ ci, mai curând, se datorează acumulării de leziuni moleculare şi structurale.

     Faptul că celulele diploide cultivate in vitro au o durată finită de viaţă nu pare a fi rezultatul lipsei de răspuns a celulelor la factori de creştere, aşa cum afirmă Yenable et al. (1994), deoarece celulele tumorale pot fi cultivate în medii complet lipsite de proteine (Chigira & Watanabe, 1993).

     Ipoteza conform căreia senescenţa clonală este un mecanism normal de evitare a cancerului, adică un mecanism homeostatic de evitare a ireversibilităţii proliferării celulare, se sprijină, aşa cum sintetizează Sager (1991) datele din literatură, pe două grupe de dovezi experimentale. Prima serie de dovezi a fost obţinută prin experienţe de transfecţie cu ADN SV40 a fibroblaştilor tineri normali din pielea umană şi apoi infectarea lor cu virus k-ras (sarcom de şobolan). Celulele devenite nemuritoare după transfecţie vor da naştere la tumori mari (la şoareci); dacă, deşi capabile să producă SV40 T-antigen, celulele transfectate cu SV40 nu devin nemuritoare, ele vor da naştere unor tumori de dimensiuni reduse, care vor îmbătrâni după aproximativ acelaşi număr de dublări ca şi cel constatat în culturi in vitro.

     A doua grupă de experienţe la care se referă Sager constă în imortalizarea celulelor epiteliale mamare umane prin transfecţie cu ADN viral obţinut de la virusul 16 sau 18 al papilomului uman, virusuri care nu erau asociate cu cancerul de sân. Imortalizarea produsă prin transfecţie cu virus de papilom este însoţită de modificări cromozomale. Nici o clonă din asemenea transfectanţi nu s-a dovedit a fi generatoare de tumori la şoareci, ceea ce demonstrează că imortalizarea poate fi separată chiar şi experimental de capacitatea de a genera tumori.

     Există şi teorii conform cărora transformarea malignă este o faţetă inevitabilă a procesului de senescenţă ce urmează acumulării de mutaţii somatice a cărei rate este determinată de leziunile ADN produse prin atacul radicalilor liberi şi de ineficienţa mecanismelor de reparare a acestor leziuni. Marusic (1991) consideră că pericolele la care sunt expuşi indivizii unei specii conduc la o micşorare a vârstei propice reproducerii sexuale cu preţul micşorării eficacităţii mecanismelor de reparare a ADN.

 

     Apoptoza sau moartea celulară programată

     Celulele pot cădea victime ale unor accidente cu urmări ireparabile (situaţie în care survine necroza celulară) sau pot muri prin executarea unui 'program de sinucidere' existent deja în informaţia genetică a celulei şi a cărui punere în lucru este declanşată de un factor intra sau extra celular. în acest din urmă caz se vorbeşte de moarte celulară programată sau apoptoză, descrisă pentru prima dată în anii '70.

     Apoptoza are loc îndeosebi în organismele multicelulare, iar raţiunea ei de a fi este legată, după cum crede Cohen (1993), de binele restului comunităţii celulare. Apoptoza se dovedeşte a fi necesară în procese ca embriogeneza, eritropoieza, homeostazia sistemului imunitar prin selecţie clonală, keratogeneza cutanată etc. Într-adevăr, conexiunile intercelulare care sunt caracteristice formelor superioare de viaţă nu ar fi posibile fără un mecanism capabil să îndepărteze, fără asocierea unui proces inflamator, celulele anormale sau pe cele care nu mai sunt necesare  (Carson & Ribeiro, 1993).

     Apoptoza se petrece în condiţii fiziologice şi este urmarea unor procese fiziologice relativ lente, care solicită participarea celulei la propria ei moarte.

     Reacţia inflamatorie consecutivă apoptozei este mult mai mică în comparaţie cu cea care urmează necrozei celulare, deoarece celula apoptotică nu se dezagregă ci e fagocitată ca atare, iar fagocitoza se desfăşoară cu o rapiditate neobişnuită. Payne et al. (1994) recomandă neutrofilele ca model pentru studiul apoptozei in vitro ; separarea celulelor apoptotice, care au densitate crescută, se face prin centrifugare.

     Mecanismul sinuciderii celulare este controlat de un program genetic foarte precis. Apoptoza începe printr-o fază preliminară reversibilă, caracterizată de o acumulare intracelulară importantă de mesageri secunzi (de tipul c-AMP, c-GMP, ITP  etc.) ca răspuns la semnalele mesagerilor primari inductori; această fază este urmată de faza ireversibilă, în care moartea celulei se produce chiar dacă stimulii inductori sunt îndepărtaţi.

     În timpul apoptozei, celula suferă modificări importante şi specifice net diferite de cele care au loc în necroză. Membrana plasmatică îşi pierde arhitectura caracteristică şi prezintă vaste zone 'băşicate', astfel încât, în final, întreaga celulă se fragmentează în câteva corpuri apoptotice (Desoize & Sen, 1992; Sen, 1992). Activarea transglutaminazei tisulare determină apariţia unor legături transversale ('cross-links') între proteine, fapt care generează complexele insolubile care sunt chiar corpurile apoptotice (Piacentini et al., 1991). Volumul celular scade iar densitatea celulei creşte. Celulele apar ca un ansamblu de  corpuri mici, condensate, în care cromatina devine granulară, intens osmiofilă şi aderă la suprafaţa membranei nucleare. în cele din urmă, cromatina se fragmentează în corpusculi compacţi legaţi de membrane şi amestecaţi la întâmplare cu alte organite subcelulare. Dipasquale & Youle (1992) demonstrează că fragmentarea nucleului este cauza şi nu efectul morţii celulare.

      Din punct de vedere biochimic, se remarcă două procese. Primul constă într-o intensificare a sintezei proteice iar cel de al doilea este fragmentarea 'în scară' a ADN-ului, adică în segmente conţinând un multiplu întreg al numărului de 180-200 de perechi de baze. Termenul 'în scară' se datorează imaginii ce rezultă prin analiza electroforetică a ADN-ului extras din celule apoptotice.

     Trebuie subliniat faptul că, spre deosebire de ADN-ul nucleic, ADN-ul mitocondrial (mt-ADN) nu este fragmentat în cursul apoptozei (Murgia et al., 1992).

     Fragmentarea ADN-ului este opera unei enzime numită endonucleaza Ca2+-Mg2+ sensibilă iar punctele de ruptură ale ADN-ului sunt plasate între nucleozomi. Endonucleaza există în permanenţă în unele celule cum sunt timocitele; la alte celule, ea poate fi exprimată prin inducţie. Endonucleaza este o proteină anionică cu o greutate moleculară mai mare de 110 kDa şi are un pH optim de 7,5. Activitatea ei este reglată de gene proto-oncogene şi oncosupresoare printre care c-myc, Ha-ras, bcl-2 şi p53 (Wyllie, 1992).

     Declanşarea apoptozei se poate realiza pe două căi principale. Prima dintre ele constă în privarea celulei de efectul protector al unor factori de creştere, factori care împiedică în mod normal activarea endonucleazei şi care împiedică punerea în mişcare a mecanismului sinucigaş al cărui punct de plecare este, totuşi, intrinsec celulei. Cea de a doua cale este activarea endonucleazei ca urmare a interacţiunii membranei celulare cu stimuli extracelulari (Franceschi, 1989).

     Owens & Cohen (1992) descriu trei moduri de activare a apoptozei şi anume, inducţia (în care are loc exprimarea unor gene ca urmare a stimulării), transducţia (în care o asemenea exprimare nu este necesară în momentul stimulării) şi eliberarea (în care apoptoza este activată prin inhibiţia exprimării genice).

     Una dintre genele implicate în apoptoză este gena c-myc, o proto-oncogenă ce intervine, de asemenea, în procesele de transformare şi de diferenţiere celulară. Faptul că c-myc participă în două procese diametral opuse cum sunt creşterea şi moartea celulară, presupune participarea în apoptoză şi a altei gene care, prin produşii ei, să determine exprimarea genei c-myc în celulă. O asemenea genă ar putea fi bcl-2 ai cărei produşi sunt, într-adevăr, capabili să prelungească viaţa celulei şi să blocheze apoptoza. Bissonnette et al. (1992) demonstrează că bcl-2 previne apoptoza indusă de c-myc, permiţând celulei să exprime gena c-myc în operaţiile de transformare celulară, fără pericolul apoptozei.

     Homeostazia ţesuturilor normale reflectă un echilibru între proliferarea celulară şi moartea celulară. Gena bcl-2 este unică în rândul proto-oncogenelor, prin aceea că este localizată în mitocondrie şi are calitatea de a bloca apoptoza, mai curând decât pe cea de a afecta proliferarea celulară (Korsmeyer, 1992). Când bcl-2 este supra-exprimată, ea protejează de apoptoză numeroase tipuri de celule, fără însă ca mecanismele prin care face aceasta să fie prea bine cunoscute. Proteina codificată de această genă are (în cazul puiului de găină) 25.687 Da şi conţine 233 de aminoacizi (Eguchi,1992). Ea este întotdeauna asociată cu membrane. Unele studii sugerează că bcl-2 este asociată cu membrana nucleară sau cu cea a reticulului endoplasmic, alte studii pledând pentru localizarea ei la nivelul membranei interne mitocondriale. Aceste din urmă studii permit să se creadă că bcl-2 previne apoptoza prin modificarea funcţiei mitocondriale şi că, prin urmare, mitocondriile ar fi implicate în apoptoză. Cu toate acestea, linii de celule umane mutante, lipsite de mt-DNA, pot muri prin apoptoză şi sunt protejate de această soartă de gena bcl-2 (Jacobson et al., 1993).

     La Caenorhabditis elegans, apoptoza normală este controlată de gena ced-9, dar faptul că gena umană bcl-2 poate preveni apoptoza şi la acest nematod arată că cele două gene sunt înrudite (Vaux, 1993).

     Aşa cum s-a amintit mai sus, în reglarea genică a apoptozei sunt implicate, de asemenea, gene oncogene şi oncosupresoare, printre care un rol aparte îl are gena c-myc, care acţionează ca un reglator bivalent, capabil să determine atât proliferarea celulei cât şi moartea ei, rezultatul depinzând de prezenţa sau de absenţa factorilor de creştere sau a unor agenţi blocanţi ai ciclului celular. Genele oncosupresoare, cum este p53, pot interveni iniţiind apoptoza în celulele în care gena c-myc este exprimată (Wyllie, 1992).

     Apoptoza poate fi declanşată de numeroşi stimuli, printre care hormonii glucocorticoizi, ionoforii de calciu (ionomycin A23187), ionofori de potasiu (valinomicină şi beauvericină), izoproterenol (Suzuki et al., 1991), dexametazon, ATP extracelular (Murgie et al.1992), virusuri oncolitice, transfecţii cu plasmide ce transportă gena p53 (Sinkovics, 1991), prostaglandină E2, colchicină (Gianakis et al., 1991), radiaţii gamma etc.

     Apoptoza mai poate fi mediată de antigenul Fas (care este o proteină aflată la suprafaţa celulei şi aparţine familiei de receptori ai factorilor de necroză tumorală) în prezenţa anticorpilor pentru Fas (Itoh & Nagata, 1993). Acest antigen este alcătuit din 306 aminoacizi, are greutatea moleculară de 34.971 Da şi dispune de un singur domeniu transmembranar (Watanabe-Fukunaba et al., 1992).

     Şi alţi factori extracelulari pot induce apoptoza. Printre aceştia, un loc aparte îl ocupă H2O2 generat prin oxidarea extracelulară a poliaminelor de către o familie de enzime numite amino-oxidaze (Parchment, 1993).

     Printre stimulii care îl declanşează se numără şi substanţe care, în concentraţii mari, pot provoca necroza celulară. Se consideră că apoptoza, din punctul de vedere al rezultatelor sale, este opusă mitozei; apoptoza contribuie la îndepărtarea celulelor nedorite sau periculoase cum sunt, de exemplu, celulele precanceroase (Schulte-Hermann et al., 1992).

     Hormonii sunt capabili şi ei să inducă apoptoza. Este cunoscut faptul că prin castrare se induce apoptoza masivă a celulelor epiteliale secretorii prostatice (Columbel et al., 1992).

     La rândul lor, unii factori fizici pot declanşa apoptoza. Aşa sunt şocurile termice (de exemplu, expunerea timp de 20 de minute a timocitelor la 43°C). Este interesant faptul că şocurile termice pot preveni apoptoza indusă de dexametam sau de ionoforii de Ca2+ (probabil, prin inhibiţia sintezei proteice necesare realizării apoptozei) (Migliorati et al., 1992). Martin & Cotter (1991) demonstrează că şi iradierea cu radiaţii ultraviolete este capabilă să declanşeze apoptoza.

     În prima fază a apoptozei se constată creşterea concentraţiei de ioni de calciu în celulă, probabil ca urmare a efectului inozitol trifosfatului (ITP) provenit din surse intracelulare sau extracelulare. De asemenea, creşte concentraţia de c-AMP precum şi cea a proteinchinazei C. într-un mod sau altul, ionii de calciu activează, în anumite condiţii, endonucleaza Ca2+-Mg2+ dependentă.

     În ceea ce priveşte sinteza proteică ce ar avea loc în apoptoză, Takano et al., (1991) pun la îndoială caracterul decisiv al rolului pe care l-ar  juca aceasta, deoarece cicloheximidina care inhibă sinteza proteică nu este capabilă să prevină apoptoza.

     Apoptoza poate fi prevenită de lipopolizaharide, interleukin 1 şi factorul de necroză tumorală alfa, gamma-interferon (Mangan et al., 1993), factorul de creştere neuronală (Kannan et al., 1992), zincul care inhibă endonucleaza, citochalazin B (Cotter et al., 1992), D2O (care previne fragmentarea ADN-ului fără, însă, a inhiba endonucleaza (Matylevich et al., 1991), spermina (şi mai puţin alte poliamine, cum ar fi spermidina) (Brune et al., 1991) etc.

     În cele din urmă, pentru curăţarea terenului, intervin macrofagele, care recunosc şi apoi fagocitează celulele apoptotice, ca urmare a faptului că pe suprafaţa acestora este expusă fosfatidilserina (Fadok et al., 1992).

Cuprins

Capitolul 7